| Περίληψη |
Ο παραδοσιακός τρόπος σκέψης που αφορά τη γονιδιακή ρύθμιση, αναθεωρήθηκε από τη σχετικά πρόσφατη ανακάλυψη των micro-RNAs και των siRNAs (small interfering RNAs), τάξεις μικρών (19-25 νουκλεοτιδίων) RNAs που παίζουν ρόλο στη μετα-μεταγραφική ρύθμιση μέσω συστατικών του RNAi μονοπατιού (RNA interference) (1). H ρύθμιση αυτή πραγματοποιείται είτε με απευθείας στόχευση των αγγελιοφόρων μορίων RNA και ακόλουθη αποδόμησή τους ή με αναστολή της διαδικασίας της μετάφρασης (2, 3, 4). Αρχικά, η ανακάλυψη των miRNAs, στηρίχθηκε στην κλωνοποίηση και στην αλληλούχιση μικρών μορίων RNA, που η πρωταρχική τους διαμόρφωση κατά την μεταγραφή εμφάνιζε μια ιδιαίτερη δομή, δομή φουρκέτας. Μια τέτοια δομή αποτελεί πρόδρομο για το τελικό miRNA μόριο (5). Στη συνέχεια αναπτύχθηκαν αρκετά αποτελεσματικές υπολογιστικές μέθοδοι που είχαν και έχουν την ικανότητα να ανακαλύπτουν πιθανά miRNAs με βάση διάφορα επιμέρους χαρακτηριστικά (διαμόρφωση φουρκέτας, συντήρηση μεταξύ των οργανισμών κα) (6, 12, 51). Εκατοντάδες miRNAs έχουν ανακαλυφθεί σε ευκαρυωτικούς οργανισμούς, γεγονός που υποδεικνύει ότι η ειδική αυτή κατηγορία των RNAs συμβάλλει στην πολυπλοκότητα της γονιδιακής ρύθμισης των οργανισμών μέσω ενός τεράστιου δικτύου ρυθμιστικών αλληλεπιδράσεων. Παρά το γεγονός όμως ότι μεγάλος αριθμός από πιθανά miRNAs έχουν προβλεφθεί στο εσωτερικό των γονιδιωμάτων, ένα ποσοστό μόνο από αυτά έχει επιβεβαιωθεί ότι μεταγράφονται σαν miRNAs και ακόμα λιγότερα έχουν επιβεβαιωμένα γονίδια στόχους και εξακριβωμένη βιολογική λειτουργία (2, 3, 17, 18). Η ανάγκη για επιβεβαίωση της ύπαρξης συγκεκριμένων miRNA μορίων στο εσωτερικό των ευκαρυωτικών οργανισμών με βάση τα αποτελέσματα πρόβλεψης των μέχρι τώρα υπολογιστικών μεθόδων, οδήγησε στην τροποποίηση μιας ήδη υπάρχουσας τεχνικής, που μπορεί να οδηγήσει στην άμεση ανακάλυψη συγκεκριμένων miRNAs στο εσωτερικό των οργανισμών με μεγάλη ευαισθησία, παρακάμπτοντας το μεγάλο χρονικό διάστημα που απαιτείται για την πραγματοποίηση του συγκεκριμένου στόχου με τη χρήση γνωστών τεχνικών (Northern) (7). Η τεχνική αυτή βασίζεται στην πραγματοποίηση ισόθερμων αντιδράσεων με τελικό αποτέλεσμα την ενίσχυση του σήματος κάποιου miRNA με τη μορφή 12-νουκλεοτιδίων (12-mers). H σταθερότητα, η ταχύτητα και η ευαισθησία του συστήματος, πιθανώς να την καταστήσουν ένα αναπόσπαστο εργαλείο στην ανακάλυψη και γενικότερα στη μελέτη miRNAs σε ένα ευρύ φάσμα ευκαρυωτικών οργανισμών. Σημαντικό πλεονέκτημα της μεθόδου μπορεί να αποτελέσει η ικανότητα ποσοτικοποίησης των εκάστοτε μη κωδικοποιών RNAs. Μια εναλλακτική προσέγγιση για την ανίχνευση GFP siRNAs από εκχυλίσματα φυτών, αναπτύχθηκε επίσης στο εργαστήριο. Η τεχνική αυτή στηρίζεται στην ικανότητα της T7 RNA πολυμεράσης να μεταγράφει ανεξάρτητα της παρουσίας υποκινητή σε μήτρα DNA, παρουσία κατάλληλων εκκινητών, σχηματίζοντας υβρίδια DNA-RNA (8, 9). Τα siRNAs είναι μόρια με χημική συγγένεια όσον αφορά τα miRNAs, τα οποία εμπλέκονται σε μονοπάτια γονιδιακής ρύθμισης και προστασίας των οργανισμών (10, 11). Επίσης τα τελευταία συμμετέχουν σε επιγενετικές τροποποιήσεις των ιστονών και του DNA οδηγώντας σε μεταγραφική σίγηση (13, 14). Ταυτόχρονα, στο εργαστήριο κλωνοποιήθηκαν κατασκευές που φέρουν το γονίδιο της GFP πρωτεΐνης με θέση πρόσδεσης για το mi399 στην Arabidopsis στο εσωτερικό της αλληλουχίας τους (15, 16). Η μεταφορά σε φυτά (αγροεμποτισμός) με τη χρήση κατάλληλων κατασκευών ελέγχου (controls) μπορεί να δώσει πληροφορίες όχι μόνο αν το συγκεκριμένο microRNA υπάρχει στο γένωμα, αλλά και αν έχει ενεργό ρόλο στη σίγηση γονιδίων μέσω κάποιου τύπου μετα-μεταγραφικής παρέμβασης.
|
Ανάπτυξη τεχνικών για την άμεση ανίχνευση μη κωδικοποιών RNAs σε εκχυλίσματα ιστών
