| Περίληψη |
Η διαδικασία αποικοδόμησης μονοαρωματικών ενώσεων και κυρίως ο μηχανισμός αποικοδόμησης της φαινόλης από το νέο βακτήριο phDV1 του γένους Pseudomonas, υπήρξε αντικείμενο μελέτης της παρούσας εργασίας. Η πλήρης αποκωδικοποίηση του γονιδιώματος του βακτηρίου Pseudomonas aeruginosa καθώς και ο λειτουργικός χαρακτηρισμός πολλών πρωτεϊνών, διαφόρων βακτηριακών στελεχών του γένους Pseudomonas υπήρξαν χρήσιμα εργαλεία στη διαδικασία μελέτης του μηχανισμού αποικοδόμησης της φαινόλης. Για τον προσδιορισμό του μεταβολικού μονοπατιού που ακολουθεί το βακτήριο για το μεταβολισμό της φαινόλης απομονώθηκε και χαρακτηρίστηκε το ένζυμο «κλειδί» στην διάσπαση του αρωματικού δακτυλίου της κατεχόλης, η 2,3 διοξυγενάση της κατεχόλης. Η απομόνωση του ενζύμου πραγματοποιήθηκε με διαβάθμισης ζάχαρης και ανιοντική χρωματογραφία, ενώ ο χαρακτηρισμός του ενζύμου έγινε με φασματοφωτομετρία υπεριώδους-ορατού και φασματομετρία μάζας. Στη συνέχεια, προσδιορίστηκαν και τα υπόλοιπα ένζυμα που συμμετέχουν στο μεταβολισμό της φαινόλης. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκε αρχικά δύο διαστάσεων ηλεκτροφόρηση μία μέθοδος που επιτρέπει το διαχωρισμό μεγάλου αριθμού πρωτεϊνών. Πιο συγκεκριμένα οι υδατοδιαλυτές πρωτεΐνες κυττάρων που καλλιεργήθηκαν σε φαινόλη και γλυκόζη, αντίστοιχα, ηλεκτροφορήθηκαν αρχικά σε πηκτές πολυακρυλαμιδίου με διαβάθμιση pH (Ισοηλεκτρική εστίαση με αμφολύτες φορείς). Στη συνέχεια ακολούθησε αποδιατακτική ηλεκροφόρηση ώστε να ληφθεί το πρωτεϊνικό αποτύπωμα των δύο δειγμάτων και να γίνει σύγκριση μεταξύ τους. Η μέθοδος αυτή δεν είχε μεγάλη επαναληψιμότητα λόγω της πρώτης διάστασης της ισοηλεκτρικής εστίασης που χρησιμοποιήθηκαν πηκτές ακρυλαμιδίου που παρασκευάσαμε με αμφολύτες φορείς. Στη συνέχεια δοκιμάστηκε κλασματοποίηση των υδατοδιαλυτών πρωτεϊνών με χρήση υπερφυγοκέντρησης σε διαβάθμιση ζάχαρης ώστε να γίνει απλούστευση και εμπλουτισμός του δείγματος με πρωτεΐνες που συμμετέχουν στο μεταβολισμό της φαινόλης Στη συνέχεια οι πρωτεΐνες ηλεκτροφορήθηκαν σε πηκτή αποδιατακτικής ηλεκτροφόρησης ώστε να εντοπισθούν πρωτεϊνικές διαφοροποιήσεις μεταξύ των δειγμάτων των διαφορετικών καλλιεργειών. Με χρήση φασματομετρίας μάζας επιτεύχθει η ταυτοποίηση όλων των βασικών ενζύμων που συμμετέχουν στο μέτα μεταβολικό μονοπάτι αποικοδόμησης της φαινόλης. Στη συνέχεια έγινε προσπάθεια προσδιορισμού πιθανών αλληλεπιδράσεων μεταξύ των ενζύμων που συμμετέχουν στο μεταβολισμό της φαινόλης με χρήση μη αποδιατακτικής ηλεκτροφόρησης (Blue Native ηλεκτροφόρηση) σε συνδυασμό με δεύτερη διάσταση αποδιατακτικής ηλεκτροφόρησης και ταυτοποίηση των πρωτεϊνών με φασματομετρία μάζας. Κατά τη διαδικασία αυτή βρέθηκαν ταυτοποιήθηκαν πρωτεϊνικά σύμπλοκα που περιέχουν ένζυμα του μεταβολισμού της φαινόλης αλλά και άλλες υδατοδιαλυτες πρωτεΐνες του κυττάρου.
|
Μελέτη του μεταβολισμού της φαινόλης από ένα νέο βακτήριο του γένους Pseudomonas
