| Περίληψη |
Η οικογένεια γονιδίων Fras1 / Frem κωδικοποιεί πρωτεΐνες της εξωκυττάριας μήτρας και περιλαμβάνει τέσσερα παράλογα γονίδια, Fras1, Frem1, Frem2 και Frem3. Ορθόλογα των γονιδίων αυτών έχουν εντοπιστεί σε γονιδιώματα μόνο δευτεροστόμιων οργανισμών, εχινόδερμα και σπονδυλωτά. Τα μέλη της οικογένειας εμφανίζουν δομικές ομοιότητες και περιλαμβάνουν μία NG2-like περιοχή με δώδεκα επαναλαμβανόμενα μοτίβα CSPG, η οποία ακολουθείται από μοτίβα Calx-β, ικανά να συγκρατούν ιόντα ασβεστίου. Η έρευνα έχει επικεντρωθεί στον ποντικό. Η έκφρασή τους έχει εντοπιστεί κατά τα μέσα στάδια της εμβρυογένεσης στο συγκεκριμένο μοντέλο. Το καταγεγραμμένο πρότυπο έκφρασης περιλαμβάνει επιθηλιακές δομές, όπως την επιδερμίδα, το πεπτικό, το αναπνευστικό, το ουρογενετικό και άλλα, με προέλευση τόσο από τα επιθηλιακά κύτταρα όσο και από γειτονικά μεσεγχυματικά. Μετά την έκκρισή τους φαίνεται να αποθέτονται στην βασική μεμβράνη σχηματίζοντας ένα πλέγμα. Με ηλεκτρονική μικροσκοπία διέλευσης παρατηρήθηκε να σχηματίζουν ινίδια τα οποία ξεκινούν από την βασική μεμβράνη με κατεύθυνση το υποκείμενο στρώμα σε μία περιοχή η οποία καλείται sub-lamina densa. Τα ‘bleb’ μεταλλαγμένα στελέχη του ποντικού προκλήθηκαν από ελαττωματικά αλληλόμορφα των παραπάνω γονιδίων. Στον άνθρωπο, η έλλειψη κάποιων από αυτά προκαλεί το σπάνιο οικογενές σύνδρομο του Fraser. Τα Fras1, Frem1 και Frem2 φαίνεται να σχηματίζουν ένα διαμοριακό σύμπλοκο το οποίο διαταράσσεται με την απουσία ενός εξ αυτών και χάνεται ο εντοπισμός και των άλλων δύο.
Στην παρούσα εργασία πραγματοποιήθηκε η μετάβαση του εντοπισμού των πρωτεϊνών Frem1 και Frem2 από τα έμβρυα στα ενήλικα. Συγκεκριμένα, μελετήθηκε η περίοδος PN1 (μία μέρα μετά την γέννηση) έως PN11. Παρατηρήθηκε πως η Frem2 πρωτεΐνη δεν γινόταν εντοπίσιμη μετά την PN3 με το κλασικό πρωτόκολλο ανοσοϊστοχημείας σε κρυοτομές. Το πρωτόκολλο τροποποιήθηκε με την εισαγωγή μίας επώασης σε ρυθμιστικό διάλυμα με όξινο Ph πριν από την επώαση στο αντίσωμα (Ph-εξαρτόμενη ανάκτηση αντιγονικότητας). Η συγκεκριμένη τροποποίηση φάνηκε να βελτιώνει την απόδωση του αντισώματος. Με τις νέες συνθήκες ελέγχθηκαν επιδερμίδες από τον κορμό και την ουρά ποντικών των προαναφερθέντων σταδίων. Η ραχιαία επιδερμίδα του κορμού εμφανίζει σταδιακή μείωση της Frem2 και ουσιαστικά εξαφανίζεται μετά την PN9. Ωστόσο, η επιδερμίδα της ουράς διατηρεί την έκφραση της συγκεκριμένης πρωτεΐνης, χωρίς οποιαδήποτε μεταβολή. Η Frem1 παρατηρείται στην βασική μεμβράνη της επιδερμίδας μέχρι την έβδομη ημέρα. Ταυτόχρονα, παρατηρείται και ενδοκυττάρια στην βασική κερατινική στιβάδα. Το ενδοκυττάριο σήμα χάνεται μετά την PN11 ραχιαία αλλά διατηρείται στην ουρά.
Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε αναζήτηση μη προσδιορισμένων πρωτεϊνών με μοτίβα CSPG. Εντοπίστηκε ένα νέο μόριο της εξωκυττάριας μήτρας, το οποίο κωδικοποιείται από το γονίδιο BC067074. Ορθόλογα του βρέθηκαν σε ιχθύες, πτηνά και θηλαστικά. Δομικά, φέρει όλα τα πρωτεϊνικά μοτίβα τα οποία συναντώνται και στην πρωτεΐνη CSPG-4 (στον ποντικό NG2), παρόλη την περιορισμένη ομολογία μεταξύ τους. Παρασκευάστηκε ειδικό αντίσωμα για την αναγνώρισή του. Με το παραχθέν αντίσωμα ελέγχθηκαν τρία στάδια της ζωής του ποντικού, έμβρυα (Ε14.5), νεογέννητα (ΡΝ1) και ποντίκια ηλικίας ενάμισι μήνα. Εντοπίστηκε μόνο σε νεογέννητα ενδοκυττάριο στην βασική κερατινική στιβάδα και μία δομή του έσω αυτιού.
|
Ανοσοϊστοχημικός εντοπισμός σε μετεμβρυικά στάδια του ποντικού των FREM1 /FREM2 & μιας νέας πρωτεΐνης της εξωκυττάριας μήτρας, της BC067074
