Your browser does not support JavaScript!

Αρχική    Study of the NF-YA transcription factor in human bone marrow mesenchymal stem cells  

Αποτελέσματα - Λεπτομέρειες

Προσθήκη στο καλάθι
[Προσθήκη στο καλάθι]
Κωδικός Πόρου 000381978
Τίτλος Study of the NF-YA transcription factor in human bone marrow mesenchymal stem cells
Άλλος τίτλος Μελέτη του μεταγραφικού παράγοντα NF-YA σε ανθρώπινα αρχέγονα μεσεγχυματικά κύτταρα μυελού των οστών
Συγγραφέας Δημητριάδου, Ανθή
Σύμβουλος διατριβής Παπαδάκη Ελένη
Μέλος κριτικής επιτροπής Καρδάσης, Δημήτριος
Ποντίκογλου Χαράλαμπος
Περίληψη Θεωρητικό Υπόβαθρο Ο μεταγραφικός παράγοντας NF-Y αποτελείται από τρεις υπομονάδες (NF-YA, NF-YB, NF-YC), όλες απαραίτητες για την πρόσδεσή του σε CCAAT μοτίβα σε υποκινητές γονιδίων. Οι υπομονάδες NF-YB και NF-YC δημιουργούν ένα σταθερό διμερές σύμπλοκο πάνω στο οποίο προσδένεται στη συνέχεια ο NF-YA, η ρυθμιστική υπομονάδα του συμπλόκου. Ο NF-YA φαίνεται να εμπλέκεται στη βιολογία των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων αλλά μέχρι τώρα δεν υπάρχουν δεδομένα που να περιγράφουν το ρόλο που διαδραματίζει στα μεσεγχυματικά αρχέγονα κύτταρα του μυελού των οστών. Σκοπός Η αξιολόγηση των επιπέδων έκφρασης του NF-YA κατά τη διάρκεια της in vitro ανάπτυξης ανθρώπινων μυελικών μεσεγχυματικών αρχέγονων κυττάρων (BM-MSCs), καθώς και ο προσδιορισμός του πιθανού ρόλου που μπορεί ο NF-YA να διαδραματίζει κατά την in vitro διαφοροποίηση των κυττάρων αυτών προς την λιποκυτταρική και οστεοβλαστική κατεύθυνση. Μέθοδοι Έγινε απομόνωση ανθρώπινων μεσεγχυματικών αρχέγονων κυττάρων από υγιείς δότες ύστερα από λήψη μυελού των οστών. Τα κύτταρα αυτά αναπτύχθηκαν in vitro μέχρι το κυτταρικό πέρασμα 10 (P10). Για τον προσδιορισμό των επιπέδων mRNA του NF-YA ακολούθησε απόμονωση ολικού RNA από διαφορετικά κυτταρικά περάσματα (P2, P6, P10). Η επαγωγή της in vitro διαφοροποίησης των BM-MSCs προς τη λιποκυτταρική και οστεοβλαστική κατεύθυνση έγινε με κατάλληλα θρεπτικά μέσα καλλιέργειας. Ακολούθησε απομόνωση ολικού RNA και πρωτεϊνών για τον προσδιορισμό των επιπέδων έκφρασης του NF-YA και ειδικών γονιδίων για την λιπογονική και οστεοβλαστική κυτταρική κατεύθυνση, σε διάφορα χρονικά διαστήματα κατά την κυτταρική διαφοροποίηση. Επιπλέον, η επαλήθευση των διαφοροποιήσεων έγινε με τη χρήση κυτταροχημικών χρώσεων. Για να επιτευχθεί σίγηση της έκφρασης του NF-YA, τα BM-MSCs διαμολύνθηκαν με ιϊκά σωμάτια που εκφραζουν shRNA για τον NF-YA (shNF-YA) και ακολούθησε διαφοροποίηση προς την λιποκυτταρική και την οστεοβλαστική κατεύθυνση. Απομόνωση ολικού RNA έγινε σε διάφορα χρονικά διαστήματα κατά τις κυτταρικές διαφοροποιήσεις. Η σχετική γονιδιακή έκφραση προσδιορίστηκε με τη μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο (real-time PCR). Όλα τα αποτελέσματα από την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης εκφράζονται 12 ως 2-ΔCt. Τα πρωτεϊνικά επίπεδα του NF-YA ανιχνεύθηκαν με τη μέθοδο του ανοσοστυπώματος Western (Western blot). Αποτελέσματα Κατά τη διάρκεια της in vitro καλλιέργειας των BM-MSCs, παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική (p=0.0296) μείωση των επιπέδων mRNA του NF-YA στο P10 σε σύγκριση με το P3 (n=9). Κατά την λιπογένεση, παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική (p=0.0478) αύξηση στα επίπεδα mRNA και πρωτεΐνης του NF-YA την 16η μέρα της διαφοροποίησης, σε σχέση με την ημέρα έναρξης της διαφοροποίησης (μέρα μηδέν), (n=14). Επιπλέον, τα επίπεδα έκφρασης του NF-YA βρέθηκαν να σχετίζονται θετικά με αυτά των PPARG (r=0.74, p&λτ.0001), C/EBPA (r=0.76, p΄&λτ0.0001) και LPL, (r=0.74, p΄&λτ0.0001). Όσον αφορά τα επίπεδα έκφρασης του NF-YA στην οστεογένεση, δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά (n=9). Για την αξιολόγηση της πιθανής λειτουργικής σχέσης του NF-YA με τη λιπογένεση και την οστεογένεση, ακολούθησε σίγηση του NF-YA και επαγωγή της διαφοροποίησης προς τη λιποκυτταρική και την οστεοβλαστική κατεύθυνση. Κατά τη διάρκεια της λιπογένεσης, τα μεταγραφικά επίπεδα του NF-YA βρέθηκαν μειωμένα κατά 51.03% στα διαμολυσμένα κύτταρα με το shNF-YA σε σχέση με τα μη διαμολυσμένα κύτταρα. Μείωση κατά 31.22%, 70.06% και 74.3% παρατηρήθηκε στα επίπεδα έκφρασης του PPARG, C/EBPA και LPL, αντίστοιχα. Τέλος, ύστερα από λιποκυτταρική χρώση (Oil Red O) παρατηρήθηκε έλλειψη λιπιδίων στα διαμολυσμένα κύτταρα με το shNF-YA σε σχέση με τα μη διαμολυσμένα. Κατά τη διάρκεια της οστεογένεσης, τα μεταγραφικά επίπεδα του NF-YA, στα διαμολυσμένα κύτταρα με το shNF-YA βρέθηκαν μειωμένα κατά 52.37% σε σχέση με τα μη διαμολυσμένα κύτταρα. Τα επίπεδα mRNA των DLX5, RUNX2, OSX and ALP παρέμειναν σταθερά μετά από σίγηση του NF-YA, αν και παρατηρήθηκε μείωση κατά 52.03% and 83.95% στα επίπεδα έκφρασης της OSC και της BSP, αντίστοιχα. Επιπλέον, ύστερα από οστεοβλαστικές χρώσεις (Alizarin Red S και Von Kossa) δεν παρατηρήθηκαν διαφορές μεταξύ των διαμολυσμένων κυττάρων με το shNF-YA και των μη διαμολυσμένων. Περίληψη/Συμπεράσματα Δείξαμε για πρώτη φορά ότι τα μεταγραφικά επίπεδα του NF-YA ελαττώνονται κατά την παρατεταμένη in vitro ανάπτυξη των BM-MSCs. Δείξαμε για πρώτη φορά ότι ο NF-YA, η ρυθμιστική υπομονάδα του ετεροτριμερούς μεταγραφικού παράγοντα NF-Y, εμπλέκεται στην διαφοροποίηση προς τη λιποκυτταρική κατεύθυνση των BM-MSCs. Πιο συγκεκριμένα, κατά τη διαφοροποίησή 13 τους προς τη λιποκυτταρική κατεύθυνση, τα επίπεδα έκφρασης του NF-YΑ αυξάνουν. Επιπλέον, τα μεταγραφικά επίπεδα του NF-YΑ συσχετίζονται θετικά με αυτά των PPARG, C/EBPA και LPL. Επιπρόσθετα, μετά την σίγηση του NF-YA, τα BM-MSCs χαρακτηρίζονται από διαταραγμένη ικανότητα in vitro λιπογονικής διαφοροποίησης. Τα αποτελέσματά μας υποδειλώνουν ότι ο NF-Y εμπλέκεται στην λιπογένεση των BM-MSCs. Αντιθέτως, κατά την επαγωγή της οστεογένεσης, δεν παρατηρήθηκε σημαντική αλλαγή των επιπέδων έκφρασης του NF-YA. Μετά τη σίγηση του NF-YA, τα επίπεδα των περισσοτέρων ειδικών γονιδίων της οστεογένεσης που ελέγχθηκαν, παρέμειναν σταθερά. Επιπλέον, ειδικές κυτταροχημικές χρώσεις για την οστεογένεση, δεν έδειξαν διαφορές μεταξύ των διαμολυσμένων με shNF-YA κυττάρων και των μη διαμολυσμένων.
Φυσική περιγραφή 40 σ : πιν. ; 30 εκ.
Γλώσσα Αγγλικά
Θέμα Adipogenesis
Bone marrow mesenchymal stem cells
C/EBPA
LPL
NF-YA
Osteogenesis
PPARG
Λιπογένεση
Μυελικά μεσεγχυματικά αρχέγονα κύτταρα
Οστεογένεση
Ημερομηνία έκδοσης 2012-07-24
Συλλογή   Σχολή/Τμήμα--Σχολή Επιστημών Υγείας--Τμήμα Ιατρικής--Μεταπτυχιακές εργασίες ειδίκευσης
  Τύπος Εργασίας--Μεταπτυχιακές εργασίες ειδίκευσης
Εμφανίσεις 45

Ψηφιακά τεκμήρια
No preview available

Προβολή Εγγράφου
Εμφανίσεις : 4