| Περίληψη |
Αντικειμενικός στόχος της παρούσας διατριβής είναι η ανάπτυξη μικροσυστοιχιών βιολογικών δειγμάτων με τη μέθοδο της απευθείας μεταφοράς με laser (LIFT- Laser Induced Forward Transfer). Η ακριβής εναπόθεση βιοπολυμερών όπως πρωτεϊνών, νουκλεϊκών οξέων και ολιγονουκλεοτιδίων, αποτελεί τη βάση για την ανάπτυξη διαφόρων ερευνητικών, αναλυτικών και διαγνωστικών εφαρμογών, όπως οι βιοαισθητήρες, τα εμβαπτιζόμενα τεστ, οι μικροσυστοιχίες πρωτεϊνών και νουκλεϊκών οξέων, και οι αναλύσεις μικροροϊκής τεχνολογίας. H μέθοδος περιλαμβάνει τη χρήση υπερβραχέων παλμών laser για την επιλεκτική απομάκρυνση και μεταφορά βιοπολυμερικών υλικών-στόχων, σε διαστάσεις που καθορίζονται από το σημείο εστίασης του laser, σε κατάλληλα επεξεργαζόμενες επιφάνειες. Η επανάληψη της διαδικασίας μεταφοράς σε διαφορετικές θέσεις του υποστρώματος και του στόχου έχει ως αποτέλεσμα την παραγωγή εκτενών σχημάτων, όπως συστοιχίες στοιχείων ή εντοπισμένες επικαλύψεις. Ο κύριος στόχος της έρευνας αυτής ήταν η διερεύνηση όλων εκείνων των ανεξάρτητων παραμέτρων που συμβάλλουν στην επιτυχή μεταφορά των βιολογικών δειγμάτων με τη μέθοδο LIFT. Συγκεκριμένα αναπτύχθηκαν μικρό-συστοιχίες βιολογικών ενώσεων όπως DNA λ-φάγου, και πρωτεϊνών σε διάφορες επιφάνειες, όπως γυαλί, νιτροκυτταρίνη και εποξικά υποστρώματα με χρήση ενός παλμικού laser (KrF) υπέρ-βραχέων παλμών (500 fs) στο μήκος κύματος (248 nm) που το βιολογικό υλικό απορροφά την ακτινοβολία. Η διαδικασία της αποδόμησης και μεταφοράς των λεπτών υμενίων λαμβάνει χώρα σε κελί χαμηλού κενού για την ελαχιστοποίηση φαινομένων διασποράς λόγω συγκρούσεων των μεταφερόμενων δομών με αέρια του περιβάλλοντος. Η μορφολογία των εναποτιθέμενων βιολογικών σχημάτων μελετήθηκε με χρήση Ηλεκτρονικής Μικροσκοπίας Σάρωσης και Οπτικής μικροσκοπίας. Η ανάλυση των μεταφερόμενων δομών έδειξε ότι αναπτύχθηκαν συστοιχίες καθορισμένων ορίων με πυκνότητα στοιχείων της τάξης των 108 / cm2 και μέγεθος δομών της τάξης των 25 μm. Η μελέτη της βιολογικής δραστικότητας των μεταφερόμενων βιολογικών δειγμάτων έγινε με χρήση ομοεστιακού μικροσκοπίου φθορισμού επαγόμενου από laser και με μεθόδους ηλεκτροφόρησης και ανάλυσης κατά Southern. Μέσω των παραπάνω τεχνικών αποδείχθηκε ότι τα ευαίσθητα βιολογικά υλικά που μεταφέρονται με τη μέθοδο LIFT, διατηρούν τις φυσικό-χημικές τους ιδιότητες και οι αναπτυσσόμενες μικρό-συστοιχίες μπορούν να χρησιμοποιηθούν για περαιτέρω αναλύσεις υβριδοποίησης και μελέτης αλληλεπιδράσεων πρωτεϊνών- πρωτεϊνών. Για τη βελτιστοποίηση της μεθόδου εναπόθεσης, μελετήθηκε επίσης η δυναμική συμπεριφορά της διαδικασίας απομάκρυνσης αυτών των βιολογικών δειγμάτων μέσω χρονικά αναλυόμενης απεικονιστικής μεθόδου Schlieren, καθώς και με χρήση streak camera, και ICCD camera. Αποδείχθηκε ότι το υλικό κατά την ακτινοβόλησή του δεν ιονίζεται, ενώ ο κύριος μηχανισμός απομάκρυνσής του είναι η διάδοση κυμάτων αραίωσης μέσα σε αυτό που το αναγκάζουν σε αποκόλλησή του από το υπόστρωμα. Επιπλέον η ταχύτητα του εκτινασσόμενου υλικού με χρήση υπέρ-βραχέων παλμών προσδιορίστηκε ίση με ~ 530 m /sec, ενώ η παρατηρούμενη στενή γωνιακή απόκλιση (2ο) κατά την απομάκρυνση του, επιβεβαιώνει πειραματικά την υπεροχή χρήσης υπέρ-βραχέων παλμών για τη δημιουργία δομών απόλυτα καθορισμένων ορίων.
|
Ανάπτυξη Βιολογικών Μικροσυστοιχιών με τη Μέθοδο Απευθείας Μεταφοράς με Laser και Μελέτη του Μηχανισμού Μεταφοράς
