| Περίληψη |
Η υποοικογένεια Β των υποδοχέων που συζεύγνυνται με τις G-πρωτεΐνες (GPCRs) περιλαμβάνει υποδοχείς που δεσμεύουν πεπτίδια όπως η σεκρετίνη, το εντερικό αγγειοδραστικό πεπτίδιο, το γλυκαγόνο, τον εκλυτικό παράγοντα της κορτικοτροπίνης (CRF), τα οποία παίζουν σημαντικό ρόλο στη λειτουργία του οργανισμού. Οι υποδοχείς αυτοί, όπως όλοι οι υποδοχείς GPCRs, είναι πρωτείνες της πλασματικής μεβράνης των κυττάρων και έχουν κοινή δομή, η οποία περιλαμβάνει επτά διαμεμβρανικές περιοχές (TMs), οι οποίες έχει δειχθεί ότι δεσμεύουν μικρά μόρια όπως η ανταλαρμίνη, ένας μη πεπτιδικός ανταγωνιστής του τύπου 1 υποδοχέα του CRF (CRF1). Αυτό οδηγεί στην υπόθεση ότι παρόμοια με την υποοικογένεια Α των GPCRs, στην οποία ανήκουν οι υποδοχείς της ροδοψίνης, οι διαμεμβρανικές περιοχές της υποοικογένειας Β των GPCRs σχηματίζουν μια κοιλότητα, την κοιλότητα θέσεων δέσμευσης, που εκτείνεται από την εξωκυττάρια επιφάνεια του υποδοχέα, μέχρι το τμήμα που βρίσκεται μέσα στη φωσφολιπιδική διπλοστιβάδα της πλασματικής μεμβράνης του κυττάρου. Η επιφάνεια της κοιλότητας αυτής σχηματίζεται από αμινοξέα που αλληλεπιδρούν με μικρά μόρια, καθώς και από άλλα που παίζουν δομικό ρόλο, επηρεάζοντας τη δέσμευση έμμεσα. Ωστόσο η έλλειψη πληροφοριών για τη δομή των υποδοχέων της υποοικογένειας Β των GPCRs καθιστά αδύνατη την επιβεβαίωση της υπόθεσης αυτής.
Για να ελέγξουμε την παραπάνω υπόθεση, αρχίσαμε να λαμβάνουμε πληροφορίες για τη δομή των υποδοχέων της υποοικογένειας Β των GPCRs, χρησιμοποιώντας ως πρότυπο τον CRF1 υποδοχέα και εξετάσαμε την αντίδρασή του με το φορτισμένο, υδρόφιλο, λιπόφοβο, μεθανοθειοσουλφονικό (MTS) αντιδραστήριο μεθανοθιοθειϊκό-αιθυλ-αμμώνιο (MTSEA). Η αντίδραση του MTSEA με τον CRF1 βασίστηκε στην ικανότητά του να αναστέλλει μη αντιστρεπτά τη δέσμευση της [125 l]--σοβαγίνης στον υποδοχέα. Η αντίδραση του MTSEA με τον CRF1 μείωσε τη δέσμευση της [125 l] -σοβαγίνης στον CRF1. Τα αποτελέσματα αυτά, σε συνδυασμό με το γεγονός ότι ο ανταγωνιστής ανταλαρμίνη προστάτεψε την προκαλούμενη από το MTSEA μείωση της δέσμευσης, οδηγεί στο συμπέρασμα ότι το αντιδραστήριο αυτό αντέδρασε με τη σουλφυδρυλική ομάδα μιας ή περισσότερων από τις ενδογενείς κυστείνες του CRF1. Για να εξακριβώσουμε την υπεύθυνη κυστείνη (-ες), μεταλλάξαμε σε σερίνες, μια την κάθε φορά, τις τέσσερις ενδογενείς κυστείνες, Cys128, Cys211, Cys233 και Cys364, που βρίσκονται στην πρώτη (TM1), τρίτη (ΤΜ3), τέταρτη (ΤΜ4) και έβδομη (ΤΜ7) διαμεμβρανική περιοχή του CRF1. Σε αντίθεση με τη μετάλλαξη της Cys128, η μετάλλαξη των Cys211, Cys233 και Cys364 σε σερίνη, μείωσε σημαντικά την ευαισθησία του υποδοχέα στο MTSEA. Τα αποτελέσματα αυτά οδηγούν στο συμπέρασμα ότι οι Cys211, Cys233 και Cys364 του CRF1, είναι προσανατολισμένες προς την κοιλότητα θέσεων δέσμευσης του υποδοχέα και η αντίδρασή τους με το MTSEA μείωσε τη δέσμευση της σοβαγίνης.
Στη συνέχεια μεταλλάξαμε ένα την κάθε φορά, 18 αμινοξέα της τρίτης διαμεμβρανικής περιοχής (ΤΜ3) του CRF1 σε κυστείνη (τεχνητές κυστείνες) και προσδιορίσαμε τη διαθεσιμότητα των τεχνητών κυστεϊνών, να αντιδράσουν με το MTSEA. Έξι από τους μεταλλαγμένους υποδοχείς αντέδρασαν με το MTSEA, υποδεικνύοντας έτσι ότι οι πλευρικές αλυσίδες των αμινοξέων αυτών είναι προσανατολισμένες προς την κοιλότητα θέσεων δέσμευσης του CRF1. Το πρότυπο αυτό της διαθεσιμότητας ήταν σύμφωνο με αυτό της δομής άλφα έλικας.
Σε αντίθεση με τις διαμεμβρανικές περιοχές του CRF1 οι οποίες έχει προταθεί ότι δεσμεύουν μικρούς μη πεπτιδικούς ανταγωνιστές, η εξωκυττάρια αμινοτελική περιοχή και οι τρεις εξωκυττάριοι βρόγχοι του υποδοχέα αλληλεπιδρούν με τα πεπτίδια της οικογένειας του CRF, όπως ο CRF και η σοβαγίνη. Σε προηγούμενες μελέτες έχει βρεθεί ότι η δεσμευμένη στον CRF1 σοβαγίνη, βρίσκεται σε κοντινή απόσταση από τη λυσίνη257 του δεύτερου εξωκυττάριου βρόγχου του υποδοχέα (EL2). Για να ελέγξουμε την υπόθεση ότι τα αμινοξέα του EL2 του CRF1 παίζουν σημαντικό ρόλο στη δέσμευση της σοβαγίνης, μεταλλάξαμε αυτά, ένα την κάθε φορά, σε αλανίνη και προσδιορίσαμε τη συγγένεια με την οποία οι μεταλλαγμένοι υποδοχείς δεσμεύαν τη σοβαγίνη. Μόνο οι μεταλλάξεις των Trp259 (W259A) και Phe260 (F260A) σε αλανίνη, καθώς και ο συνδυασμός τους (W259A/F260A), μείωσαν τόσο τη συγγένεια δέσμευσης σοβαγίνης όσο και την ισχύ του πεπτιδίου αυτού να διεγείρει την παραγωγή κυκλικού AMP σε κύτταρα που εκφράζανε τον CRF1. Σε αντίθεση, οι μεταλλάξεις αυτές δε φάνηκε να επηρεάζουν σημαντικά τη στερεοδιαμόρφωση του CRF1, αφού δε μείωσαν τη συγγένεια δέσμευσης της αστρεσίνης και της ανταλαρμίνης, οι οποίες έχει βρεθεί ότι δεσμεύονται σε διαφορετικές περιοχές του CRF1. Οι μεταλλάξεις W259A, F260A και W259A/F260A μείωσαν επίσης και τη συγγένεια δέσμευσης του CRF, υποδηλώνοντας ότι τα αμινοξέα Trp259 και Phe260 πιθανόν παίζουν έναν κοινό σημαντικό ρόλο στη δέσμευση διαφορετικών πεπτιδίων που ανήκουν στην οικογένεια του CRF. Απαλοιφή αμινοξέων από τον CRF και τη σοβαγίνη επηρέασε τις συγγένειες δέσμευσής τους για τον άγριο τύπο CRF1 και τους μεταλλαγμένους υποδοχείς, W259A, F260A και W259A/F260A, με τέτοιο τρόπο που οδήγησε στο συμπέρασμα ότι τα αμινοτελικά αμινοξέα των πεπτιδίων στις θέσεις 8-10 της σοβαγίνης και των αντίστοιχων του CRF, αλληλεπιδρούν με τα Trp259 και Phe260 του EL2 του CRF1. Αυτή είναι η πρώτη φορά που μια συγκεκριμένη περιοχή του CRF1 εμπλέκεται σε λεπτομερείς αλληλεπιδράσεις μεταξύ του υποδοχέα και της αμινοτελικής περιοχής των πεπτιδίων που ανήκουν στην οικογένεια του CRF.
|
Μελέτη της δομής και λειτουργίας του τύπου 1 υποδοχέα του εκλυτικού παράγοντα της κορτικοτροπίνης
