Your browser does not support JavaScript!

Αρχική    Βιολογικοί και γενετικοί δείκτες στη διαφοροδιάγνωση των πλευριτικών συλλογών  

Αποτελέσματα - Λεπτομέρειες

Προσθήκη στο καλάθι
[Προσθήκη στο καλάθι]
Κωδικός Πόρου 000365698
Τίτλος Βιολογικοί και γενετικοί δείκτες στη διαφοροδιάγνωση των πλευριτικών συλλογών
Άλλος τίτλος Biologic and genetic markers for differential diagnosis of pleural effusion.
Συγγραφέας Οικονομίδου, Φωτεινή
Σύμβουλος διατριβής Σιαφάκας, Νικόλαος
Μέλος κριτικής επιτροπής Τζωρτζάκη, Ελένη
Σχίζα , Σοφία
Αντωνίου, Μαρία
Περίληψη Οι πλευριτικές συλλογές είναι μια συνηθισμένη εκδήλωση διαφόρων νοσημάτων. Περίπου το 20% των πλευριτικών συλλογών οφείλονται σε κακοήθειες και το 50% αυτών οφείλονται σε καρκίνο του πνεύμονα. Η κακοήθης πλευριτική συλλογή είναι η πρώτη εκδήλωση της νόσου σε ποσοστό που κυμαίνεται από 10 έως 50%. Η κυτταρολογική εξέταση του πλευριτικού υγρού είναι η βασική μέθοδος για την διάγνωση της κακοήθειας και η ευαισθησία της είναι 50-70%. Η τυφλή βιοψία του υπεζωκότα μπορεί να χρησιμοποιηθεί συμπληρωματικά για τη διάγνωση της κακοήθειας. Όμως μεταξύ των κυτταρολογικά αρνητικών περιπτώσεων μόνο στο 7% αποδείχθηκε κακοήθεια διαμέσου της βιοψίας του υπεζωκότα ενώ ένα 20% των πλευριτικών συλλογών παραμένουν αδιάγνωστες. Τέλος οι μετρήσεις διαφόρων καρκινικών δεικτών στο πλευριτικό υγρό όπως το καρκινοεμβρυϊκό αντιγόνο (CEA) μπορεί να φανούν χρήσιμες στην διαφοροδιάγνωση των πλευριτικών συλλογών και οι ευαισθησίες τους είναι σχετικά υψηλές, όμως τέτοιες μέθοδοι δεν είναι επιβεβαιωμένες. Είναι γνωστό ότι η κυτταρολογική εξέταση δίνει αρνητικό αποτέλεσμα στις περιπτώσεις που το πλευριτικό υγρό περιέχει λιγότερα από 1-10% κακοήθη κύτταρα, ενώ οι μοριακές μέθοδοι που χρησιμοποιούν την PCR μπορεί να ξεχωρίσουν ανωμαλίες σε ένα από τα 105-106 κύτταρα. To μικροδορυφορικό DNA αποτελείται από επαναλαμβανόμενα μοτίβα των 1-6 ζευγών νουκλεοτιδίων τα οποία ανευρίσκονται σε όλα τα προκαρυωτικά και ευκαρυωτικά κύτταρα. Στις περισσότερες περιπτώσεις αποτελούν τμήματα “non-coding DNA” και σπανιότερα περιοχών που κωδικοποιούν κάποιες πρωτείνες. To μικροδορυφορικό DNA παρουσιάζει μεγάλη ποικιλία πολυμορφισμού. Με τη χρήση της PCR (polymerase chain reaction) το μικροδορυφορικό DNA έχει μετατραπεί σε ένα χρήσιμο γενετικό δείκτη. Το μικροδορυφορικό DNA έχει αποδειχθεί ένα εξαιρετικό εργαλείο της γονιδιακής χαρτογράφησης πολλών οργάνων με διάφορες εφαρμογές από ιατροδικαστικές μελέτες, μελέτες αποδόμησης του DNA έως διατήρηση 34 και διαχείριση βιολογικών πηγών. Τέλος μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως ένα εργαλείο γονιδιακού διαχωρισμού σε διάφορες μελέτες μοριακής επιδημιολογίας. Η Αστάθεια του Μικροδορυφορικού DNA σχετίζεται με υψηλούς ρυθμούς μετάλλαξης και η διαδικασία της μετάλλαξης διαφέρει ανάμεσα στους διάφορους γονιδιακούς τόπους, τα είδη, την ηλικία, το φύλο. Ο υψηλός ρυθμός μεταλλαξογένεσης στις μικροδορυφορικές αλληλουχίες μπορεί να εξηγηθεί από δύο κυρίως μηχανισμούς. Ο πρώτος σχετίζεται με λάθη κατά την αντιγραφή του DNA (slippage event) και ο δεύτερος με ανωμαλία στον μηχανισμό αποκατάστασης των λαθών κατά την αντιγραφή (DNA mismatch repair system). Ο μηχανισμός αποκατάστασης λαθών κατά την αντιγραφή του DNA συμβάλλει στο να διατηρηθεί η γονιδιακή σταθερότητα, διορθώνοντας τα λάθη που συμβαίνουν κατά την αντιγραφή. Η δυσλειτουργία του συστήματος αυτού μπορεί να οδηγήσει στο χάσιμο της χρωμοσωμικής σταθερότητας γεγονός που παίζει ρόλο στην καρκινογένεση. Υπάρχουν δύο τύποι γενετικής αποσταθεροποίησης. Ο ένας είναι η χρωμοσωμική αστάθεια που έχει σαν αποτέλεσμα τον ανευπλοϊδισμό και ο άλλος η αστάθεια του μικροδορυφορικού DNA που δημιουργείται λόγω λαθών κατά την αντιγραφή σύντομων νουκλεοτιδικών αλληλουχιών. Ανάμεσα στα γονίδια που παίζουν το σημαντικότερο ρόλο στα διάφορα στάδια της καρκινογένεσης είναι τα ογκοκατασταλτικά γονίδια. Έχει αποδειχθεί ότι η αλλαγή του γενετικού υλικού σε μία και μόνο αλληλουχία (η απώλεια της ετεροζυγωτίας) μπορεί να οδηγήσει σε καρκινογένεση. Η αστάθεια του μικροδορυφορικού DNA έχει βρεθεί σε 15% σποραδικών περιπτώσεων με καρκίνο του παχέως εντέρου καθώς και σε διάφορες άλλες κακοήθειες όπως του πνεύμονα, του γαστρεντερικού, του ενδομητρίου, των ωοθηκών, του στήθους, του προστάτη, της ουροδόχου κύστης, της κεφαλής και του αυχένα, και του μελανώματος. Έχουν ήδη μελετηθεί αρκετές χρωμοσωμικές γενετικές αλλαγές σχετικά με τον καρκίνο του πνεύμονα στον άνθρωπο. Η έλλειψη της ετεροζυγωτίας στο χρωμόσωμα 8p είναι μια πρόσφατη ανακάλυψη στον καρκίνο του πνεύμονα. Άλλες περιοχές όπου συχνά 35 συμβαίνουν αλλαγές στην αλληλουχία των νουκλεοτιδίων είναι αυτές των χρωμοσωμάτων 1p, 3p, 5p, 9p, 13p, 17p, και 17q. Στην δημιουργία των πλευριτικών συλλογών εμπλέκεται και η αγγειογένεση, ο ρόλος της όμως στην παθογένεια των συλλογών αυτών δεν είναι πλήρως διευκρινισμένος. Η αγγειογένεση συνίσταται από την ισορροπία μεταξύ θετικών και αρνητικών ρυθμιστικών παραγόντων οι οποίοι δρώντας μέσω διαφόρων οδών έχουν σαν αποτέλεσμα την αναπαραγωγή, την διαφοροποίηση και την οργάνωση των ενδοθηλιακών κυττάρων σε ένα λειτουργικό δίκτυο αγγειακών καναλιών. Αυτοί οι ρυθμιστικοί παράγοντες έχουν κάποια αγγειογενετική επίδραση και η συντονισμένη συνεργασία τους είναι σημαντική για την αγγειακή ανάπτυξη. Αγγειογενετικές κυτταροκίνες όπως ο vascular endothelial growth factor (VEGF) και ο basic fibroblast growth factor (bFGF) είναι υπεύθυνοι για την δημιουργία των πλευριτικών συλλογών διότι εμπλέκονται στην νεοαγγείωση, στην αγγειακή διαπερατότητα και την αιμορραγία τόσο σε φλεγμονώδης καταστάσεις όσο και στην ογκογένεση. Η έκφραση επομένως τέτοιων αγγειογενετικών παραγόντων μπορεί να αποτελέσει ένα χρήσιμο δείκτη στη διάγνωση και στην παρακολούθηση της πορείας της νόσου. Έχει ήδη αποδειχθεί ότι ο VEGF παίζει ένα σπουδαίο ρόλο στη δημιουργία συγκεκριμένων πλευριτικών συλλογών. Πολλές μελέτες δείχνουν ότι ο VEGF είναι σημαντικά υψηλότερος στις εξιδρωματικές από τις διιδρωματικές πλευριτικές συλλογές. Επίσης οι κακοήθεις πλευριτικές συλλογές φαίνεται να σχετίζονται με υψηλότερα επίπεδα VEGF από τις καλοήθεις πλευριτικές συλλογές. Υποστηρίζεται ότι τα αυξημένα επίπεδα του VEGF στις κακοήθεις πλευριτικές συλλογές αυξάνουν την διαπερατότητα των μεμβρανών και οδηγούν στη συσσώρευση του πλευριτικού υγρού. Παρά το ότι υπάρχουν στατιστικά σημαντικές διαφορές στα επίπεδα του VEGF μεταξύ κακοηθών και καλοηθών πλευριτικών συλλογών, περιπτώσεις αλληλοεπικάλυψης καθιστούν τον VEGF ως μη χρήσιμο διαγνωστικά δείκτη από μόνο του. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι ο endothelial cell-specific receptor tyrosine kinase (Tie2) και οι αγγειοποϊετίνες 1 και 2 (Ang-1, Ang-2), παίζουν κάποιο διαφορετικό διαμεσολαβητικό ρόλο στην αγγειογένεση. Έχει αποδειχθεί ότι η Ang-2 δρα ως 36 ανταγωνιστικός υποδοχέας για το Tie-2 συνδεόμενο μαζί του με όμοια συγγένεια, αλλά ανταγωνίζεται την Ang-1, μπλοκάρωντας την φωσφορυλίωση και ενεργοποίηση του Tie-2. Ποντίκια με υπερέκφραση της Ang-2 έχουν όμοια ελαττώματα με ποντίκια που έχουν έλλειψη της Ang-1 ή του Tie-2, γεγονός που δείχνει ότι η Ang-2 δρα σαν φυσικός ανταγωνιστής των Ang-1/Tie-2. Με βάση αυτή την αντίληψη πρόσφατα δημοσιεύτηκε ότι τα επίπεδα της Ang-2 και όχι αυτά της Ang-1 σχετίζονται με τις εξιδρωματικές πλευριτικές συλλογές, υποστηρίζοντας ότι η Ang-2 μαζί με το VEFG συμμετέχουν στην πλευριτική φλεγμονή και την παθογένεια των εξιδρωματικών πλευριτικών συλλογών. Αντιθέτως υποστηρίζεται ότι η Ang-2 παίζει κάποιο ρόλο στην ενεργοποίηση του Tie-2 receptor προκαλώντας in vitro την αγγειογένεση. Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι ο ρόλος της Ang-2 είναι πιο περίπλοκος, αφού δρα είτε προωθώντας είτε αμβλύνοντας την δράση του Tie-2 receptor στα ενδοθηλιακά κύτταρα ανάλογα με τις τοπικές καταστάσεις. Τον τελευταίο καιρό επίσης, το ενδιαφέρον των ερευνητών εστιάζεται σε μία συγκεκριμένη οικογένεια υποδοχέων κυτταροκινών που καλούνται CXCR4 και έχει βρεθεί ότι παίζουν σημαντικό ρόλο στην λοίμωξη από HIV. Ο stromal-cell derived factor-1α (SDF-1α/CXCL12) είναι μέλος της οικογένειας των CXC κυτταροκινών και έχει βρεθεί ότι δρα ως χημειοτακτικός παράγοντας για CD34+ αιμοποιητικά προγονικά κύτταρα, μεγακαρυωκύτταρα, B κύτταρα και T κύτταρα. O SDF-1α/CXCL12 εκφράζεται πάνω σε συγκεκριμένους ιστούς. Αν και οι περισσότεροι υποδοχείς κυτταροκινών συνδέονται με αρκετές κυτταροκίνες, ο CXCR4 είναι ειδικός υποδοχέας, διότι αλληλεπιδρά μόνο με το SDF-1α. Η εμπλοκή των CXCR4 και SDF-1α στην διαδικασία αυτή, κάνει το ζεύγος κυτταροκίνη-υποδοχέα σημαντικού ενδιαφέροντος στην δημιουργία των μεταστάσεων. Το τελευταίο διάστημα, αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι η τάση της δημιουργίας μεταστάσεων από διαφορετικούς τύπους καρκίνου, πνεύμονα, μαστού, ωοθηκών, νεφρών και προστάτη, σχετίζεται με την έκφραση του CXCR4. Επίσης έχει βρεθεί ότι στο μη μικροκυττατικό καρκίνο του πνεύμονα καθώς και στο καρκίνο του μαστού η σύνδεση του CXCR4 με το CXCL12 παρουσιάζει μέγιστα επίπεδα έκφρασης στα όργανα που μεθίστανται. 37 Στην παρούσα διδακτορική διατριβή διερευνήσαμε τον ρόλο του Tie-2 στην παθογένεια των πλευριτικών συλλογών μελετώντας το μονοπάτι δράσης του VEGF μέσω του υποδοχέα της αγγειοποετίνης Tie-2, το ρόλο του VEGF, των αγγειοποϊετινών (Ang-1 και Ang-2) και του βιολογικού άξονα CXCL12 - CXCR4 στο μηχανισμό της δημιουργίας μεταστάσεων στην υπεζωκοτική κοιλότητα από καρκίνο του πνεύμονα και τέλος αν η γενετική ανάλυση του πλευριτικού υγρού σε συγκεκριμένους μικροδορυφορικούς δείκτες μπορεί να συμβάλλει στην διάγνωση των κακοήθων πλευριτικών συλλογών, συγκριτικά με την κυτταρολογική ανάλυση των συλλογών αυτών. Πιο αναλυτικά, σχετικά με το ρόλο της αγγειογένεσης στις πλευριτικές συλλογές, μελετήσαμε 67 δείγματα πλευριτικών συλλογών και ορών από περιφερικό αίμα ασθενών που νοσηλεύτηκαν στο Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Ηρακλείου Κρήτης από τον Ιανουάριο του 2004 έως τον Αύγουστο του 2005. Από τους 67 ασθενείς που συμπεριλήφθηκαν στη μελέτη μας οι 41 ήταν άνδρες και οι 26 γυναίκες μέσης ηλικίας 73.5 ετών (IQR, 20 ως 95 έτη). 17 ασθενείς είχαν διιδρωματική πλευριτική συλλογή λόγω καρδιακής ανεπάρκειας και 50 εξιδρωματική διαφορετικής αιτιολογίας: 22 κακοήθεις (12 από καρκίνο του πνεύμονα και 10 από μεταστατική εξωπνευμονική κακοήθεια), 15 φλεγμονώδεις (12 παραπνευμονικές και 3 φυματιώδεις), και 13 αδιάγνωστες. Σε όλα τα πλευριτικά υγρά και στους ορούς από το περιφερικό αίμα μετρήθηκαν τα επίπεδα της lactate dehydrogenase (LDH), της γλυκόζης, του pH, και των κυττάρων. Επίσης μετρήθηκαν οι συγκεντρώσεις των VEGF, bFGF and Tie-2 στο πλευριτικό υγρό και το αίμα 66, 66 και 62 ασθενών αντίστοιχα, με μέθοδο ELISA. Τα κυριότερα ευρήματά μας ήταν τα ακόλουθα: (1) Τα επίπεδα του VEGF στο πλευριτικό υγρό αλλά όχι των bFGF και Tie-2 ήταν σημαντικά αυξημένα στα εξιδρώματα συγκριτικά με τα διιδρώματα, (2) Τα επίπεδα του Tie-2 στο πλευριτικό υγρό δεν διέφεραν μεταξύ κακοηθών και φλεγμονωδών πλευριτικών συλλογών καθώς και μεταξύ διιδρωμάτων και εξιδρωμάτων, (3) Ο λόγος του VEGF βρέθηκε να σχετίζεται με το λόγο της LDH και της ολικής πρωτεΐνης. 38 Συμπερασματικά η μελέτη μας αυτή επιβεβαίωσε ότι ο VEGF παρουσιάζει μια προς τα πάνω αυτορρύθμιση στις εξιδρωματικές πλευριτικές συλλογές διαφόρων αιτιών. Από την άλλη πλευρά, βρέθηκε ότι αυτή η παθογενετική επίδραση δεν γίνεται μέσω της οδού των angiopoietins/Tie-2, αφού δεν βρήκαμε καμία διαφορά στα επίπεδα του Tie-2 στια πλευριτικά υγρά. Άρα η μέτρηση των επιπέδων των αγγειογενετικών μεσολαβητών δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί για διαγνωστικούς σκοπούς. Τέλος τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι ο VEGF πιθανά να έχει ένα σημαντικό ρόλο στην παθογένεια των εξιδρωματικών πλευριτικών συλλογών όχι μόνο λόγο της αγγειογενετικής του λειτουργίας αλλά και ως επαγωγέας της αγγειακής διαπερατότητας. Επίσης μελετήσαμε 25 ασθενείς, 7 με διιδρωματική πλευριτική συλλογή λόγω καρδιακής ανεπάρκειας και 18 εξιδρωματικές κακοήθεις πλευριτικές συλλογές (7 από SCLC και 11 από NSCLC). Στα δείγματα αυτά πραγματοποιηθήκε ανάλυση της έκφρασης των VEGF και αγγειοποϊετινών 1 και 2 και CXCL12 (και των δύο αντιγράφων, TR1 και TR2) /CXCR4 στο κυτταρικό ίζημα των πλευριτικών υγρών με real-time RT-PCR, ενώ η έκφραση των πρωτεϊνών των VEGF και SDF μετρήθηκε με western blot ανάλυση. Από τη μελέτη αυτή βρέθηκε ότι τα επίπεδα του SDF-TR1 (p =0.02) αλλά όχι του SDF-TR2 (p=0.23) ή του CXCR4 (p=0.23) ήταν υψηλότερα στις κακοήθεις πλευριτικές συλλογές. Τα επίπεδα του SDF-TR1 (p=0.04) και όχι αυτά των SDF- TR2 (p=0.04) και CXCR4 (p=0.123) ήταν υψηλότερα στις πλευριτικές συλλογές από SCLC. Τέλος, στις πλευριτικές συλλογές από NSCLC βρέθηκαν υψηλότερα τα επίπεδα του SDF-TR1 (p=0.03) και όχι των SDF-TR2 (p=0.6) και CXCR4 (p=0.4). Η Ang-1 δεν εκφράστηκε σε κανένα δείγμα, ενώ δεν βρέθηκε καμία σημαντική διαφορά στην έκφραση του VEGF και της Ang-2 μεταξύ κακοηθών πλευριτικών συλλογών και διιδρωμάτων, γεγονός που μας οδήγησε στο συμπέρασμα ότι ο VEGF δεν φαίνεται να συμμετέχει στην παθοφυσιολογία των πλευριτικών συλλογών μέσω των αγγειοποϊετινών. Η έκφραση των πρωτεϊνών όμως ανιχνεύθηκε αυξημένη για το VEGF και το SDF στις κακοήθεις πλευριτικές συλλογές. Έτσι καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι τα επίπεδα μόνο του SDF-1α αυξάνονται στις κακοήθεις πλευριτικές συλλογές, γεγονός που δείχνει την συμμετοχή του SDF-1α στη δημιουργία των μεταστάσεων στην υπεζωκοτική κοιλότητα. 39 Τέλος, μελετήσαμε 48 πλευριτικά υγρά από 12 γυναίκες και 36 άνδρες μέσης ηλικίας 71 ετών (38-97 έτη) που νοσηλεύτηκαν στην Πνευμονολογική Κλινική του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Ηρακλείου Κρήτης από το Σεπτέμβριο του 2005 έως το Δεκέμβριο του 2006. Από αυτούς οι 26 είχαν κακοήθη πλευριτική συλλογή (23 από καρκίνο του πνεύμονα και 3 από μεταστατική εξωπνευμονική κακοήθεια). Πιο συγκεκριμένα σε 16 άτομα διεγνώσθη μη μικροκυτταρικός καρκίνος πνεύμονα, σε 6 μικροκυτταρικός καρκίνος πνεύμονα, σε 1 μεσοθηλίωμα, σε 2 μεταστατικό αδενοκαρκίνωμα στήθους και σε 1 μεταστατικό αδενοκαρκίνωμα ενδομητρίου. 19 ασθενείς είχαν ιστορικό καπνίσματος (median pack years 60) και 7 ήταν μη καπνιστές. Η ομάδα ελέγχου αποτελούνταν από καλοήθεις πλευριτικές συλλογές (7 αδιάγνωστα εξιδρώματα, 3 διιδρώματα λόγω καρδιακής ανεπάρκειας, 11 παραπνευμονικές συλλογές και 1 φυματιώδη πλευριτική συλλογή). Η μέση ηλικία της ομάδας ελέγχου ήταν 66.5 έτη (38-97 έτη). 17 ασθενείς είχαν ιστορικό καπνίσματος (median pack years 30) και 5 ήταν μη καπνιστές. Κυτταρολογική εξέταση έγινε σε όλα τα πλευριτικά υγρά και ήταν θετική σε 14 κακοήθεις πλευριτικές συλλογές ενώ ήταν αρνητική για όλες τις καλοήθεις πλευριτικές συλλογές. Μελετήθηκαν έξι πολυμορφικοί μικροδορυφορικοί δείκτες (D17S250, D9S171, D3S1234, D12S363, D5S346, TP53Alu), οι οποίοι βρίσκονται κοντά σε γονίδια που σχετίζονται με την παθογένεια του καρκίνου. Οι ανωτέρω δείκτες μελετήθηκαν με μέθοδο PCR. Σε δύο από τους 26 (7.6%) ασθενείς με κακοήθη πλευριτική συλλογή βρέθηκε γενετική αλλαγή. Ένας ασθενείς με μη μικροκυτταρικό καρκίνο πνεύμονα παρουσίασε MSI σε τρεις διαφορετικούς μικροδορυφορικούς δείκτες (D17S250, D9S171, D3S134) και ένας ασθενής με μη μικροκυτταρικό καρκίνο πνεύμονα παρουσίασε LOH στο δείκτη D3S134. Ένας από τους 22 (4.5%) ασθενείς με καλοήθη πλευριτική συλλογή (παραπνευμονική) παρουσίασε LOH στο δείκτη D3S134. Όλα τα υπόλοιπα δείγματα πλευριτικών υγρών και των δύο ομάδων έδειξαν μικροδορυφορική σταθερότητα. Καταλήξαμε επομένως στο συμπέρασμα ότι η μοριακή ανάλυση του μικροδορυφορικού DNA του κυτταρικού 40 ιζήματος των πλευριτικών υγρών δεν μπορεί να αυξήσει την ευαισθησία της κλασσικής κυτταρολογικής εξέτασης
Φυσική περιγραφή 139 σ : πιν. ; 30 εκ.
Γλώσσα Ελληνικά
Θέμα Agiogenesis
Microsatellite DNA instability
Pleural effusions
Respiratory system
Αγγειογένεσης
Αναπνευστικό σύστημα
Αστάθεια μικροδοριφορικού DNA
Παράσιτα
Πλευριτικές συλλογές
Ημερομηνία έκδοσης 2009-04-07
Συλλογή   Σχολή/Τμήμα--Σχολή Επιστημών Υγείας--Τμήμα Ιατρικής--Διδακτορικές διατριβές
  Τύπος Εργασίας--Διδακτορικές διατριβές
Εμφανίσεις 69

Ψηφιακά τεκμήρια
No preview available

Προβολή Εγγράφου
Εμφανίσεις : 9