| Περίληψη |
Τα τελευταία χρόνια όλο και περισσότερες μελέτες υποδεικνύουν την κρίσιμη
σημασία της πρωτεόλυσης στα είδη του φύλου των Apicomplexa. Οι παρασιτικές
πρωτεάσες εμπλέκονται σε πολύ εξειδικευμένες λειτουργίες των παράσιτων
σημαντικές για την επιβίωση του οργανισμού καθώς και σε διεργασίες που αφορούν
την αλληλεπίδραση του με τα κύτταρα του ξενιστή. Συνολικά, ο κρίσιμος ρόλος των
πρωτεασών στους μηχανισμούς εισβολής των κυττάρων, στον εξειδικευμένο
μεταβολισμό του παρασίτου, στην αποφυγή του ανοσοποιητικού συστήματος του
ξενιστή, στον μηχανισμό εξόδου από το κύτταρο, στην παθογονικότητα, στην αύξηση
καθώς και στην ανάπτυξη του παρασίτου έχουν μετατρέψει τα μόρια αυτά σε
σημαντικούς φαρμακευτικούς στόχους.
Ανάμεσα στις πρωτεάσες που ερευνώνται εντατικά στα Apicomplexa είναι
μέλη της οικογένειας των πρωτεασών σερίνης. Ωστόσο, ο κρίσιμος ρόλος των μορίων
αυτών στην φυσιολογία των παρασίτων και στις αλληλεπιδράσεις του με τα κύτταρα
του ξενιστή καθώς επίσης και το απλοειδές γονιδίωμα του παρασίτου για τον
μεγαλύτερο μέρος του κύκλου ζωής του, συχνά περιπλέκουν τη λειτουργική ανάλυση
τους. Για αυτούς τους λόγους πολλές προσπάθειες διαγραφής γονιδίων πρωτεασών
σερίνης από το γένωμα των παρασίτων, όπως επίσης και έκφραση ανασυνδυασμένων λειτουργικών μορίων για τον βιοχημικό χαρακτηρισμό τους έχουν αποτύχει επανειλημμένα. Επιπλέον, από άλλες μελέτες υποδεικνύεται ότι η χρήση χημικών
αναστολέων πρωτεασών μειονεκτεί σημαντικά λόγω του μεγάλου εύρους δράσης
τους. Για αυτό το λόγο κρίνεται απαραίτητο να αναπτυχθούν εναλλακτικές
προσεγγίσεις απενεργοποίησης της λειτουργίας των κρίσιμων πρωτεασών για την
επιβίωση του παρασίτου προκειμένου να επιτευχθεί η μελέτη τους.
Στην εργασία αυτή προτείνεται η χρήση πεπτιδικών αναστολέων πρωτεάσεων
(macromolecular protease inhibitors, MPIs) ως εργαλεία προκειμένου να
παρεμποδιστούν in vivo οι λειτουργίες παρασιτικών πρωτεασών. Βάση της
προσέγγισης αυτής έχει δημιουργηθεί μία συλλογή από φυσικά και μοριακά
τροποποιημένους αναστολείς πρωτεασών σερίνης προκειμένου να στοχεύθουν τα
αντίστοιχα πρωτεολυτικά μόρια του Τ. gondii. Τα MPIs μόρια συνήθως ρυθμίζουν
κρίσιμα πρωτεολυτικά φαινόμενα απενεργοποιώντας πρωτεάσες. Η εκτεθειμένη
λούπα αλληλεπίδρασης του αναστολέα αναγνωρίζεται από την πρωτεάση στόχο καθώς μιμείται δομικά το υπόστρωμα των πρωτεασών στόχων. Γεγονός, που ενισχύει την χρήση των μορίων αυτών ως εργαλεία στην μελέτη αυτή είναι το ότι έχουν υπάρξει βιβλιογραφικές αναφορές εξειδικευμένης αναστολής, από φυσικά
απομονωμένους ή τροποποιημένους αναστολείς που χρησιμοποιήθηκαν για την
αντιμετώπιση μολυσματικών ασθενειών.
Συνολικά σε αυτή την διατριβή παρουσιάζεται η in vivo έκφραση μοριακά
τροποποιημένων ή φυσικά απομονομένων μορίων MPIs στο Toxoplasma gondii
προκειμένου να πραγματοποιηθεί η απενεργοποίηση πρωτεολυτικών τροποποιήσεων
στο αναπτυξιακό στάδιο του ταχυζωιδίου. Επιπλέον, λόγω του καλύτερου
χαρακτηρισμού του εκκριτικού μονοπατιού στο είδος αυτό πραγματοποιήθηκαν
προσπάθειες στόχευσης των μικρονηματίων, εξειδικευμένων εκκριτικών οργανιδίων
που παίζουν κυρίαρχο ρόλο στον μηχανισμό της εισβολής των παρασίτων ως
προσπάθεια στόχευσης των πρωτεολυτικών μονοπάτιων των μικρονηματίων κατά την
εισβολή του παρασίτου στα κύτταρα.
Όλοι οι αναστολείς επιλέχθηκαν ως πιθανοί αναστολείς παρασιτικών
πρωτεασών σερίνης και χρησιμοποιήθηκαν για την κατασκευή διαγονιδιακών
στελεχών τα οποία έκφραζαν τα μόρια αυτά μέσα στο εκκριτικό μονοπάτι του
παρασίτου. Η in vivo έκφραση αυτών των MPIs μορίων και ο χαρακτηρισμός των
διαγονιδιακών στελεχών που κατασκευάστηκαν επέτρεψε τον λειτουργικό έλεγχο των ΜΡΙs ως αντιπαρασιτικά μόρια και έθεσε τις βάσεις για την ανάπτυξη μελετών
μεγάλης εμβέλειας προεκειμένου να ανιχνευθούν επιπρόσθετα εξειδικευμένοι ΜPIs
αναστολείς έναντι κρίσιμων παρασιτικών πρωτεασών.
|
Χρήση των ταχυζωιδίων του T. Gondii για τον λειτουργικό έλεγχο φυσικών ή μοριακά τροποποιημέων αναστολέων πρωτεασών : διερεύνηση της δυνατότητας χρήσης τους ως αντιπαρασιτικές ουσίες.
