| Περίληψη |
«Μελέτη της αστάθειας του μικροδορυφορικού DNA σε υποπληθυσμούς κυττάρων σε χρόνια αποφρακτική νόσο των πνευμόνων».
Η Χρόνια Αποφρακτική Πνευμονοπάθεια (ΧΑΠ) αποτελεί μια από τις κυριότερες αιτίες νοσηρότητας και θνητότητας παγκοσμίως και έχει ως αποτέλεσμα οικονομική και κοινωνική επιβάρυνση, η οποία είναι ουσιαστική και αυξανόμενη. Αν και η ΧΑΠ είναι μια ασθένεια συχνή, της οποίας ο κυριότερος αιτιολογικός παράγοντας είναι γνωστός και είναι το κάπνισμα τσιγάρων, εντούτοις πολλά ερωτήματα παραμένουν αδιευκρίνιστα σε ότι αφορά την παθογένεια της νόσου και ιδιαίτερα την επίδραση γενετικών, περιβαλλοντικών αλλά και επιγενετικών παραγόντων[1,2].
Το γενετικό υπόβαθρο της ΧΑΠ έχει αποτελέσει το επίκεντρο πολλών πρόσφατων μελετών [3]. Σημαντικός φαίνεται να είναι ο ρόλος των επίκτητων σωματικών μεταλλάξεων στην παθογένεση της ΧΑΠ [4,5]. Οι επίκτητες σωματικές μεταλλάξεις θεωρούνται σποραδικές αλλαγές σε γονίδια ή περιοχές ελέγχου των γονιδίων, οι οποίες προκύπτουν αυτόματα και μάλλον σπάνια. Η συχνότητα των μεταλλάξεων αυτών όμως αυξάνεται κατά πολύ σε ιστούς οι οποίοι εκτίθενται σε επαναλαμβανόμενες εξωγενείς μεταλλαξιογόνες 24
προσβολές. Αν και η «ευπάθεια» στην εμφάνιση μεταλλάξεων κατ’αυτόν τον τρόπο ενδέχεται να υπόκειται σε έλεγχο από κληρονομούμενα γονίδια, οι σωματικές μεταλλάξεις δεν κληρονομούνται [4].
Η απώλεια ετεροζυγωτίας και η αστάθεια του μικροδορυφορικού DNA είναι γενετικές αλλοιώσεις οι οποίες αποτελούν φαινόμενα που έχουν ανευρεθεί στις περισσότερες ανθρώπινες κακοήθειες [6-12]. Πρόσφατες μελέτες ωστόσο, ανέδειξαν ότι η LOH και η MSI ανευρίσκονται και σε αρκετές καλοήθεις παθήσεις, πνευμονικές και έξω-πνευμονικές [5,6,13-15]. Σε πρόσφατες μελέτες από την ομάδα μας ανιχνεύθηκαν αστάθεια του μικροδορυφορικού DNA ή/και απώλεια ετεροζυγωτίας σε δείγματα κυττάρων πτυέλων ασθενών με ΧΑΠ και βρογχικό άσθμα [5,13-15]. Ωστόσο ο συγκεκριμένος κυτταρικός υποπληθυσμός, ο οποίος εμφανίζει την γενετική αυτή αστάθεια δεν έχει εξακριβωθεί. Ετσι, σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν αφ’ενός να εξετάσει την παρουσία επίκτητων σωματικών γενετικών αλλοιώσεων σε κύτταρα πτυέλων και βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος καθώς και η διερεύνηση του συγκεκριμένου κυτταρικού πληθυσμού που εμφανίζει τις αλλοιώσεις αυτές. Η αναγνώριση του κυτταρικού πληθυσμού που είναι ευπαθής σε βλάβες του DNA στην ΧΑΠ, μπορεί να διαφωτίσει ένα σημαντικό κομμάτι της παθογένεσης της νόσου. Η φυσική ικανότητα του πνεύμονα να λύνει την φλεγμονή και να ξεκινά ιστική επιδιόρθωση μετά απο έκθεση σε εισπνεόμενους βλαπτικούς παράγοντες είναι μια 25
διαδικασία η οποία εξαρτάται από την ακεραιότητα των μηχανισμών αυτόματης επιδιόρθωσης του DNA, κάτι που όπως φαίνεται δεν ισχύει στην ΧΑΠ.
Μελετήθηκαν συνολικά 35 ασθενείς με ΧΑΠ και 30 μάρτυρες («υγιείς καπνιστές»). Όλοι οι ασθενείς με ΧΑΠ ανήκαν στο στάδιο ΙΙ κατα GOLD [16] και ήταν πρώην καπνιστές για διάστημα τουλάχιστον 6 μηνών. Οι «υγιείς» καπνιστές ήταν νυν και πρώην καπνιστές.
Οι ασθενείς με ΧΑΠ χωρίστηκαν σε δύο ομάδες: η πρώτη ομάδα (Α) αποτελούνταν από 20 ασθενείς με ΧΑΠ οι οποίοι υποβλήθηκαν σε πρόκληση πτυέλων. Η μέση ηλικία της ομάδας ήταν 69 ±9 έτη και η μέση καπνιστική συνήθεια 50.5±14 πακέτα/έτη. Από τον σπιρομετρικό έλεγχο οι τιμές μετά βρογχοδιαστολή ήταν: FEV1 (% pred): 61 ±8, FVC (% pred): 77±12 and FEV1/FVC: 59 ±4.
Η δεύτερη ομάδα (Β) αποτελούνταν από 15 ασθενείς με ΧΑΠ οι οποίοι υποβλήθηκαν σε βρογχοσκόπηση και βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα για διαγνωστικούς λόγους άσχετους με την παρούσα μελέτη. Η μέση ηλικία της ομάδας ήταν 64±11 έτη και η μέση καπνιστική συνήθεια 61.3±13 πακέτα/έτη. Από τον σπιρομετρικό έλεγχο οι τιμές μετά βρογχοδιαστολή ήταν FEV1 (% pred): 63 ±11.5, FVC (% pred): 78±9 and FEV1/FVC: 58 ±6.
Η ομάδα ελέγχου (μάρτυρες) αποτελούνταν από 30 καπνιστές με φυσιολογικό λειτουργικό έλεγχο πνευμόνων. Η μέση ηλικία της ομάδας 26
ήταν 56±17 έτη και η μέση καπνιστική συνήθεια 52±9 πακέτα/έτη. Από τον σπιρομετρικό έλεγχο οι τιμές μετά βρογχοδιαστολή ήταν FEV1 (% pred): 92±4, FVC (%pred): 88±4 and FEV1/FVC (%): 83±8.
Στα δείγματα πτυέλων και τα δείγματα BAL έγινε επεξεργασία διαχωρισμού του κυτταρικού συσωματώματος με τεχνολογία μαγνητικών σφαιριδίων σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Dynabeads, Dynal, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA για τα πτύελα και MACS magnetic beads technology/MiniMACS magnetic separation columns, MACS Technology, Miltenyi Biotec, Germany). Όλα τα δείγματα διαχωρίστηκαν σε δυο προϊόντα: α) τα επιθηλιακά κύτταρα και β) τα λευκοκύτταρα (CD 45+). Η τεχνική του μαγνητικού διαχωρισμού επιβεβαιώθηκε με την χρήση του κυτταρομετρητή ροής (COULTER EPICS XL Flow Cytometer, Beckman Coulter, USA).
Στη συνέχεια οι δυο υπο-ομάδες κυττάρων (επιθηλιακά και λευκοκύτταρα) καθώς και δείγμα περιφερικού αίματος κάθε ασθενούς υποβλήθηκαν σε εκχύλιση DNA σύμφωνα με το σύνηθες πρωτόκολλο (QIAmp DNA Blood Mini kits; QIAGEN, Inc., Valencia, CA, USA). Τα δείγματα DNA υποβλήθηκαν σε ενίσχυση για τους μικροδορυφορικούς δείκτες G29802, D6S2223, D6S344, D6S263, D5S207, D13S71, RH70958, and D17S250 με την μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR).
27
Σε κανένα από τους «υγιείς» καπνιστές που μελετήθηκαν δεν ανευρέθηκε γενετική αστάθεια. Στους ασθενείς με ΧΑΠ βρέθηκαν αλλοιώσεις μικροδορυφορικού DNA μόνο στα δείγματα επιθηλιακών κυττάρων και όχι στα δείγματα λευκοκυττάρων. Συγκεκριμένα στην ομάδα Α (προκλητά πτύελα) 5 ασθενείς εμφάνισαν γενετική αστάθεια (25%). Τρεις ασθενείς εμφάνισαν LOH στους δείκτες D6S344 (1), G29802 (1) και D17S250 (1), και δύο ασθενείς εμφάνισαν MSI στους δείκτες D13S71 (1) and D6S344 (1). Στην ομάδα Β (δείγματα BAL) επτά ασθενείς εμφάνισαν γενετική αστάθεια (47%). LOH ανιχνεύθηκε σε τέσσερις ασθενείς στους δείκτες D5S207 (2), G29802 (1) και D17S250 (1), ενώ MSI σε 6 ασθενείς στους δείκτες D5S207 (1) και D13S71 (5).
Το κύριο εύρημα της μελέτης αυτής είναι ότι οι σωματικές αλλοιώσεις του DNA σε δείγματα πτυέλων και βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος, ανευρέθηκαν αποκλειστικά στα επιθηλιακά κύτταρα. Η παρατήρηση αυτή μπορεί να έχει ιδιαίτερη σημασία αν λάβουμε υπ’οψιν μας τον κεντρικό ρόλο που κατέχουν τα επιθηλιακά κύτταρα στην παθογένεια της ΧΑΠ [17].
Τα ευρήματα της μελέτης αυτής υποστηρίζουν την υπόθεση για τα αρχικά γεγονότα στην παθογένεια της ΧΑΠ [18,19], οτι δηλαδή η επίμονη φλεγμονή και το οξειδωτικό φορτίο απο το κάπνισμα των τσιγάρων δύναται να επηρεάσει το σύστημα φραγμού μεταξυ αέρα και 28
πνεύμονα δηλαδή τα επιθηλιακά πνευμονικά κύτταρα (Lung epithelial Barrier Cells –LEBCs) [20]. Η περαιτέρω απενεργοποίηση του συστήματος αυτόματης επιδιόρθωσης των βλαβών του DNA (human DNA mismatch repair system –MMR) λόγω του αυξημένου οξειδωτικού φορτίου, πιθανον να έχει ως εκ νέου αποτέλεσμα επίκτητες σωματικές μεταλλάξεις στο μικροδορυφορικό DNA των επιθηλιακών πνευμονικών κυττάρων (LEBCs), αντανακλώντας έτσι μια δυσλειτουργική μετάπτωση των επιθηλιακών πνευμονικών κυττάρων στην ΧΑΠ [20].
|
Μελέτη αστάθειας μικροδορυφορικού DNA σε υποπληθυσμούς κυττάρων σε χρόνια αποφρακτική νόσο των πνευμόνων
