| Περίληψη |
Ο όγκος Wilms ή νεφροβΛάστωμα αντιπροσωπεύει ένα από τα συχνότερα νεοπΛάσματα της παιδικής ηΛικίας, καθώς και το συχνότερο ενδοκοιΛιακό νεόπΛασμα σε παιδιά ηΛικίας μικρότερης των δέκα ετών. Παρουσιάζει την ίδια περίπου συχνότητα και στα δύο φύΛα και η μέση ηΛικία κατά τη διάγνωση ετερόπΛευρου όγκου είναι τα τρία έτη. Ένα σημαντικό χαρακτηριστικό του όγκου Wilms είναι η συσχέτισή του με συγγενείς ανωμαΛίες, οι συνηθέστερες από τις οποίες είναι οι καΛοήθεις ανωμαΛίες του ουρογεννητικού συστήματος, η ημιϋπερτροφία και η σποραδική ανιριδία. Είναι ένας όγκος που μπορεί να εντοπιστεί σε οποιοδήποτε σημείο των νεφρών. Εμφανίζεται συνήθως ως μία ασυμπτωματική μάζα της κοιΛιάς ή των Λαγόνων και ανακαΛύπτεται συνήθως από τους γονείς ή κατά την παιδιατρική εξέταση παρακοΛούθησης. Το 50% των προσβεβΛημένων παιδιών εμφανίζουν κοιΛιακά άΛγη, εμέτους, απώΛεια βάρους και ανορεξία. Η υπέρταση, που αναφέρεται στο 60% των ασθενών, προκύπτει Λόγω νεφρικής ισχαιμίας, συνήθως οφειΛόμενη σε πίεση της νεφρικής αρτηρίας από τον όγκο. Περιστασιακά ο όγκος μπορεί να αιμορραγήσει προκαΛώντας ενοχΛήσεις στην περιοχή των νεφρών και αιματουρία. Η μάζα, σε γενικές γραμμές, είναι Λεία και συμπαγής και σπανίως περνά τη μέση γραμμή. Μακροσκοπικά ο όγκος έχει σαφή όρια και περιβάΛΛεται από κάψα. Μικροσκοπικά φαίνεται να προέρχεται από αρχέγονα μεσοδερμικά κύτταρα του μεσόνεφρου και αποτεΛείται από μείγμα τριών ξεχωριστών τύπων κυττάρων: μεσεγχυματογενή, επιθηΛιακά και βΛαστικά κύτταρα, με ποικιΛία στο βαθμό διαφοροποίησης για τον κάθε υπότυπο. ΠΛήρης αποδιαφοροποίηση, που καΛείται και αναπΛασία, παρατηρείται στο 10% των περιπτώσεων, ταξινομείται ως βΛαστικό στοιχείο και έχει τη χειρότερη πρόγνωση, αφού αντιστοιχεί στο 60% των θανάτων. Αυτός ο ιστοΛογικός τύπος, με τη δυσμενή πρόγνωση, χαρακτηρίζεται από κύτταρα που έχουν μέγεθος τριπλάσιο του φυσιολογικού, με υπερχρωματικούς πυρήνες και ανώμαλες μιτώσεις, εξελίσσεται ταχύτατα και δίνει αιματογενείς μεταστάσεις συνήθως στους πνεύμονες. Ένα άλλος παράγοντας που έχει συσχετιστεί με την πρόγνωση είναι και η ύπαρξη νεφρογενών υπολειμμάτων είτε γύρω είτε εντός του νεφρικού παρεγχύματος.
Στην προσπάθεια διερεύνησης του μοριακού μηχανισμού ανάπτυξης του όγκου, έχει διαπιστωθεί πως εμπλέκονται δύο γονιδιακοί τόποι στο χρωμόσωμα 11: ο 11p13 (WT1) και ο 11p15 (WT2). Οι ημιζυγωτικές κλασσικές διαγραφές ενός από αυτούς τους γονιδιακούς τύπους, 11p13, σχετίζονται επίσης με δύο σπάνια σύνδρομα τα οποία περιλαμβάνουν στις εκδηλώσεις τους τον όγκο Wilms: α) το σύνδρομο WAGR (όγκος, ανιριδία, δυσπλασίες ουρογεννητικού συστήματος και διανοητική καθυστέρηση) και β) το σύνδρομο Denys-Drash (όγκος, νεφροπάθεια και ανωμαλίες γεννητικού συστήματος). Η ύπαρξη δεύτερου γεννητικού τόπου 11p15, μπορεί να ερμηνεύει τη συσχέτιση του όγκου Wilms με το σύνδρομο Beckwith-Wiedemann, ένα συγγενές σύνδρομο που χαρακτηρίζεται από αρκετούς τύπους εμβρυικών νεοπλασμάτων, ημιϋπερτροφία, μακρογλωσσία και σπλαχνομεγαλία. Η ανάπτυξη τελικά του όγκου Wilms είναι πολύπλοκη και πιθανώς εμπλέκονται και άλλοι γενετικοί τόποι. Στον καρκίνο των νεφρών των ενηλίκων γίνεται μια προσπάθεια τα τελευταία χρόνια ελέγχου της έκφρασης των ογκογονιδίων ras και raf, γονίδια που ανήκουν στο μονοπάτι των MAP κινασών.
Το γονίδιο Ras αρχικά αναγνωρίστηκε ως ογκογονίδιο του "Rat Sarcoma Virus". Στη συνέχεια βρέθηκε ότι η Ras πρωτεΐνη εμπλέκεται σε σηματοδοτικά μονοπάτια έξι κατηγοριών: α) αυξητική ρύθμιση των ινοβλαστών, β) εξαλλαγή των ινοβλαστών, γ) διαφοροποίηση και ωρίμανση των αιμοποιητικών κυττάρων, δ) ενεργοποίηση των Τ-λεμφοκυττάρων, ε) νευρωνική διαφοροποίηση των κυττάρων φαιοχρωμοκυττώματος και στ) αναστολή ωρίμανσης των επιθηλιακών κυττάρων. Φαίνεται λοιπόν ότι το γονίδιο Ras και η αντίστοιχη μεμβρανική πρωτεΐνη που κωδικοποιεί εμπλέκονται στο σηματοδοτικό μονοπάτι του αυξητικού παράγοντα (GF) και επομένως στη μιτογένεση του κυττάρου. Συγκεκριμένα, όταν ο GF συνδεθεί με τον μεμβρανικό του υποδοχέα, ενεργοποιείται η ανενεργή μορφή της πρωτεΐνης GDP-Ras και μετατρέπεται στην ενεργή μορφή GTP-Ras. Με άμεση επίδραση της GTP-Ras στη Raf κινάση, ενεργοποιείται η καταλυτική δράση της κινάσης και μέσω φωσφορυλίωσης ενεργοποιείται ο καταρράκτης των κινασών Raf/MEK/ERK, καταλύοντας την επαγωγή μιτογόνων σημάτων στον πυρήνα του κυττάρου με αποτέλεσμα τον έλεγχο του κυτταρικού κύκλου. Με τη δράση της GTPase η ενεργή μορφή της Ras υδρολύεται σε GDP-Ras και ελέγχεται ο κυτταρικός κύκλος. Σε μεταλλάξεις των γονιδίων αυτών, το μιτογόνο σήμα δε διακόπτεται με αποτέλεσμα να προάγεται ο κυτταρικός κύκλος, χωρίς εξωκυττάριο έλεγχο. Πρόσφατες μελέτες έδειξαν, ότι εκτός από την επαγωγή μιτογόνων σημάτων, η πρωτεΐνη Ras επιδρά έμμεσα στα επίπεδα των κυκλινών επηρεάζοντας το πέρασμα από την φάση G1 στη φάση S του κυτταρικού κύκλου. Είναι γνωστά τρία μέλη της οικογένειας των γονιδίων Ras, τα γονίδια H-K- και N-Ras. Το γονίδιο H-Ras βρίσκεται στη χρωμοσωμική θέση 11p15, το K-Ras στη 12p12 και το N-Ras στη θέση 1p13, ενώ οι μεταλλάξεις τους συνήθως αφορούν τα κωδικόνια 12, 59 και 61 αντίστοιχα. Τέτοιες μεταλλάξεις ανευρίσκονται σε διάφορους καρκίνους και προκαρκινικές καταστάσεις, όπως στο κακοήθες μελάνωμα, σε νεοπλασίες του θυρεοειδούς αδένα, κακοήθειες του παχέος εντέρου και της ουροδόχου κύστης.
Παραπάνω έγινε αναφορά και στην πρωτεΐνη Raf που αποτελεί μέρος του μονοπατιού Ras/Raf/MEK/ERK. Αυτή κωδικοποιείται από το αντίστοιχο γονίδιο. Η ομάδα γονιδίων Raf περιλαμβάνει το B-Raf, το A-Raf 1 και το Raf 1. Το A-Raf 1 συναντάται στη θέση Xp11.3-11.23 και η πρωτεΐνη που κωδικοποιεί έχει δράση σερίνης-θρεονίνης κινάσης με ρόλο μεταγωγής σήματος. Το γονίδιο Raf 1 εντοπίζεται στη θέση 3p25, η αντίστοιχη δε πρωτεΐνη είναι εκτελεστικός λειτουργός των πρωτεϊνών Ras και συμμετέχει στον καταρράκτη σήματος της ERK κινάσης, με τη διαδικασία φωσφορυλίωσης των πρωτεϊνών MEK. Ο ρόλος του γονιδίου σχετίζεται με τον κυτταρικό κύκλο, τον πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση και την απόπτωση. Το B-Raf γονίδιο βρίσκεται στη χρωμοσωμική θέση 7q34. Είναι λειτουργικό γονίδιο και η πρωτεΐνη που κωδικοποιεί ανήκει στην κατηγορία πρωτεϊνών σερίνης-θρεονίνης κινάσης και συμβάλλει στην επαγωγή μιτογόνων σημάτων από την κυτταροπλασματική μεμβράνη στον πυρήνα του κυττάρου. Εμπλέκεται στον κυτταρικό κύκλο, ενώ φαίνεται να έχει και αντι-αποπτωτική δράση. Σημειακές μεταλλάξεις στο ρυθμιστικό τμήμα της κινάσης, έχουν ως αποτέλεσμα τη διαρκή ενεργοποίησή της, επιδρώντας έτσι στη διαδικασία του κυτταρικού κύκλου.
Η έλλειψη σημαντικής γνώσης γύρω από το ρόλο των γονιδίων αυτών σε παιδικούς όγκους νεφρού, καθώς και η συμμετοχή των γονιδίων WT1 και WT2 σε μονοπάτια των MAP κινασών, οδήγησε στη σκέψη να διερευνήσουμε τα γονίδια Ras και Raf σε όγκους Wilms.
Η πειραματική διαδικασία που ακολουθήθηκε ήταν η ακόλουθη. Συλλέχθηκαν 32 ιστοί εγκλεισμένοι σε παραφίνη όγκων Wilms από το παιδιατρικό νοσοκομείο «Αγ. Σοφία» Αθηνών και από το Γ.Ν. «Γ. Γεννηματάς» Θεσσαλονίκης σε ένα χρονικό διάστημα 3 ετών. Επίσης συλλέχθηκαν 10 αντίστοιχοι ιστοί από φυσιολογικό νεφρικό παρέγχυμα, νεφρών που αφαιρέθηκαν για μη νεοπλασματική παθολογία. Ακολούθησε εξαγωγή εκχυλίσματος DNA και αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης με περιοριστικά ένζυμα (ενδονουκλεάσες), ειδικά για τους γενετικούς τόπους των συχνότερων μεταλλάξεων των υπό εξέταση γονιδίων. Με τη διαδικασία αυτή, ανιχνεύθηκε η πιθανότητα να συμμετέχει στην παθοφυσιολογία των όγκων Wilms, κάποια μετάλλαξη στα εν λόγω γονίδια. Ο έλεγχος ήταν αρνητικός και κανένα από τα 32 δείγματα δεν ήταν φορέας κάποιας μετάλλαξης. Έπειτα ακολούθησε εκχύλιση RNA από τους ίδιους ιστούς, καθώς και από τους φυσιολογικούς. Από το RNA παρασκευάστηκε με rt-PCR το cDNA και εκεί εφαρμόστηκε real-time PCR, όπου ανιχνεύτηκε η έκφραση των συγκεκριμένων γονιδίων στους όγκους σε σχέση με τους φυσιολογικούς ιστούς, χρησιμοποιώντας ως γονίδιο αναφοράς το γονίδιο της ΰ-ακτίνης. Με τα αποτελέσματα των πειραμάτων πραγματοποιήθηκε στατιστική ανάλυση και καταγραφή των σημαντικότερων αποτελεσμάτων.
Όπως αναφέρθηκε ήδη τα τρία Ras γονίδια και το B-Raf δεν παρουσίασαν κάποια μετάλλαξη στους όγκους Wilms που μελετήσαμε.
Σχετικά με την έκφραση του mRNA των εν λόγω γονιδίων, παρατηρήθηκαν κάποια ενδιαφέροντα αποτελέσματα. Αρχικά καταγράφηκε μια συνολική υπερέκφραση των γονιδίων και ειδικότερα μια ήπια αύξηση για τα H-Ras και K-Ras, ενώ μια μεγαλύτερη των B-Raf και του N-Ras. Επίσης αποκαλύφθηκε ότι η υπερέκφραση αυτή ειδικά για το K-Ras και το B-Raf ήταν μεγαλύτερη για τους μεγάλους όγκους (>10εκ.) σε σχέση με τους μικρότερους. Για την έκφραση του H-Ras παρατηρήθηκε μία συσχέτιση με το ποσοστό νέκρωσης του όγκου. Συγκεκριμένα μεγαλύτερη έκταση της νέκρωσης συνεπαγόταν μειωμένη έκφραση και το αντίστροφο. Μεγαλύτερη έκταση της νέκρωσης, είχε επίσης ως αποτέλεσμα μια απορρύθμιση στην έκφραση του K-Ras. Το πιο εντυπωσιακό όμως στατιστικό αποτέλεσμα είχε να κάνει με το διαφορετικό εκφραστικό προφίλ των συγκεκριμένων γονιδίων σε σχέση με τα ιστολογικά γνωρίσματα του όγκου. Συγκεκριμένα ανάλογα με το ποσοστό των επιμέρους ιστολογικών χαρακτήρων, επιθηλιακό, μεσεγχυματογενή ή ΰλαστικό, υπήρχε διαφορετική συμμετοχή στην έκφραση των γονιδίων. Έτσι το N-Ras φάνηκε να υπερεκφράζεται όταν υπερτερεί το ΰλαστικό ή το στρωματικό στοιχείο σε αντίθεση με το B-Raf, το οποίο υπερεκφράζεται σε όγκους που πρωτεύον ιστολογικό χαρακτηριστικό ήταν το επιθηλιακό στοιχείο. Τα άλλα δύο γονίδια (H- και K-Ras) δεν παρουσίασαν αντίστοιχες διακυμάνσεις. Ένα άλλο ενδιαφέρον αποτέλεσμα αφορούσε στο προφίλ συνέκφρασης των γονιδίων. Ενώ στα φυσιολογικά δείγματα, υπήρχε γενικά ανεξάρτητη έκφραση των γονιδίων της μελέτης, στα περιστατικά από τους όγκους, ανιχνεύτηκε πολύ πιο συχνή συσχέτιση μεταξύ των εκφράσεων των mRNA των γονιδίων.
Η αιτιολογία της εμφάνισης των όγκων Wilms δεν έχει ακόμα ερμηνευτεί πλήρως, παρόλη την επιτυχημένη πρόοδο στη θεραπευτική προσέγγιση και το προσδόκιμο επιβίωσης. Παράγοντες περιγενετικοί και περιβαλλοντικοί φαίνεται ότι συμμετέχουν στην παθοφυσιολογία, καθώς και ιστολογικοί δείκτες, όπως τα νεφρογενή υπολείμματα. Γονιδιακοί τόποι των γονιδίων WT1 και WT2 επίσης έχουν ενοχοποιηθεί και ταυτοποιηθεί ως μέρος του μηχανισμού εμφάνισης του νεοπλάσματος. Τα γονίδια Ras και B-Raf ανήκουν στα συχνότερα γονίδια που συμμετέχουν είτε με μεταλλάξεις είτε με συμμετοχή των μονοπατιών στα οποία οι πρωτεΐνες τους καθορίζουν, σε όγκους διαφόρων οργάνων. Η ιδέα ότι παίζουν κάποιο ρόλο και σε αυτό το παιδιατρικό νεόπλασμα έχει ερευνηθεί μόνο μερικώς και έτσι η μελέτη μας, προσπάθησε να προσθέσει κάποια νέα ευρήματα στο συγκεκριμένο πεδίο. Παρόλο που δεν ανιχνεύθηκε στα δείγματα που μελετήσαμε κάποια μετάλλαξη των γονιδίων αυτών, υπήρξε μία διαταραχή στην έκφρασή τους. Τα γονίδια K-Ras και B-Raf έχουν βρεθεί να έχουν θετική συσχέτιση όσον αφορά την έκφρασή τους με το μέγεθος διαφόρων όγκων, όπως παγκρεατικό καρκίνο, μεσοθηλίωμα, ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα, μελάνωμα, θυρεοειδικό καρκίνωμα κ.α. Εμείς παρατηρήσαμε μια αντίστοιχη συσχέτιση με το μέγεθος των όγκων Wilms. Επίσης η συσχέτιση με το ποσοστό νέκρωσης και τη μειωμένη έκφραση του H-Ras μπορεί να συσχετιστεί με την υπόθεση βάσει ερευνών ότι το wild-type Η-Ras δρα προστατευτικά και επάγει την απόπτωση
σε περιπτώσεις απορρύθμισης του κυτταρικού κύκΛου. ΤέΛος το γεγονός της διαφορετικής εκφραστικής συμπεριφοράς των γονιδίων N-Ras και B-Raf ανάΛογα με τα ιστοΛογικά χαρακτηριστικά των όγκων ήταν εντυπωσιακό. Το στρωματικό και βΛαστικό νεοπΛασματικό ιστοΛογικό προφίΛ που είναι κατά τεκμήριο δυσμενέστερης πρόγνωσης από το επιθηΛιακό, παρουσίασαν μία αναΛογία με την υψηΛότερη έκφραση του N-Ras, ενώ το επιθηΛιακό στοιχείο, που συνήθως είναι θετικός προγνωστικός δείκτης, είχε περισσότερο σύνδεση με υπερέκφραση του B-Raf.
Η συγκεκριμένη μεΛέτη πέρα από κάποια ενδιαφέροντα αποτεΛέσματα παρουσιάζει και κάποιες αδυναμίες και περιορισμούς, όπως ο μικρός σχετικά αριθμός των υπό εξέταση περιστατικών. Βέβαια, ο πΛηθυσμός της χώρας και ο επιποΛασμός του συγκεκριμένου νεοπΛάσματος δεν επιτρέπει εύκοΛη συΛΛογή περισσότερων δειγμάτων. Το ίδιο ισχύει και για τα φυσιοΛογικά δείγματα, αφού δεν προκύπτει εύκοΛα χειρουργικό παρασκεύασμα μη νεοπΛασματικού νεφρού σε παιδικές ηΛικίες για να χρησιμοποιηθεί ως δείγμα συγκριτικής αναφοράς.
Συμπερασματικά, η συγκεκριμένη μεΛέτη, κατάφερε να παραγάγει κάποια ενδιαφέροντα συμπεράσματα σχετικά με την παθοφυσιοΛογία των όγκωνν/Μιτ^ και τη συμμετοχή των γονιδίων Ras και B-Raf. Τα αποτεΛέσματα, αρχικά παρουσιάστηκαν ως αναρτημένη ανακοίνωση σε διεθνές συνέδριο και τεΛικά δημοσιεύτηκαν στο περιοδικό Medical Oncology, υπό τον τίτΛο «K-Ras, H-Ras, N-Ras and B-Raf mutation and expression analysis in Wilms tumors: Association with tumor growth»
|
Ανίχνευση και διερεύνηση του ρόλου σημειακών μεταλλάξεων των ογκογονιδίων H-, K- και N-ras, καθώς και του B-raf σε όγκους Wilms
