E-Locus - Ιδρυματικό Καταθετήριο Πανεπιστημίου Κρήτης - Κλωνοποίηση, έκφραση γονιδίων δύο νέων απακετυλασών χιτοολιγοσακχαριτών : απομόνωση, βιοχημικός χαρακτηρισμός

Αρχική Κλωνοποίηση, έκφραση γονιδίων δύο νέων απακετυλασών χιτοολιγοσακχαριτών : απομόνωση, βιοχημικός χαρακτηρισμός

Αποτελέσματα - Λεπτομέρειες

[Προσθήκη στο καλάθι]

Κωδικός Πόρου

000351285

Τίτλος

Κλωνοποίηση, έκφραση γονιδίων δύο νέων απακετυλασών χιτοολιγοσακχαριτών : απομόνωση, βιοχημικός χαρακτηρισμός

Άλλος τίτλος

Cloning and expression of two novel chitooligosaccharide deacetylases

Συγγραφέας

Δελή, Αλεξάνδρα

Σύμβουλος διατριβής

Μπουριώτης, Βασίσλης

Περίληψη

Τα γονιδιώματα τόσο του Bacillus cereus όσο και του συγγενικού του οργανισμού Bacillus anthracis περιέχουν δύο μέλη της πρωτεϊνικής οικογένειας LmbE, ομόλογα μεταξύ τους. Τα μέχρι σήμερα χαρακτηρισμένα μέλη της οικογένειας αυτής είναι ένζυμα με ενεργότητα απακετυλάσης της Ν-ακετυλ γλυκοσαμίνης (GlcNAc) της Ν-ακετυλγλυκοσαμινυλφωσφατιδυλ ινοσιτόλης, του 1-D-μυο-ινοσιτυλ-2-ακεταμιδο-2-δεοξυ-α-D-γλυκοπυρανοσιδίου, της Ν,Ν’-διακετυλχιτοβιόζης και λιπογλυκοπεπτιδικών αντιβιοτικών. Τα γονίδια bc1534 και bc3461 από τον B. cereus ATCC14579 κλωνοποιήθηκαν και εκφράστηκαν σε E. coli. Τα ανασυνδυασμένα ένζυμα απομονώθηκαν και χαρακτηρίστηκαν βιοχημικά. Εμφανίζουν διαφορές στα μοριακά βάρη, καθώς και στις βέλτιστες συνθήκες pH και θερμοκρασίας, ενώ όπως και τα άλλα μέλη της οικογένειας είναι απακετυλάσες GlcNAc μεγάλου εύρους υποστρωμάτων, όπως του μονομερούς GlcNAc, Ν-ακετυλχιτοολιγομερή (GlcNAc_2-4) καθώς και τροποποιημένα υποστρώματα όπως GlcNAc–1P, GlcNAc–6P, GalNAc, ManNAc, UDP-GlcNAc. Αντίθετα και τα δύο ένζυμα δεν είναι ενεργά σε ραδιενεργά σημασμένη γλυκολ-χιτίνη, σε Ν-ακετυλ-D-γλυκοσαμινυλ-(β-1,4)-Ν-ακετυλμουραμυλ-L-αλανυλ-D-ισογλουταμίνη (GMDP) και σε Ν-ακετυλ-D-Ν-γλυκοσαμινυλ-α1-6-D-μυο-ινοσιτολ-1-HPO₄-οκταδεκυλ (GlcNAc-I-P-C₁₈). Κινητική ανάλυση των πρωτεϊνών BC1534, BC3461 προς τα υποστρώματα GlcNAc_1-2 σε συνδυασμό με πειράματα ελλιμενισμού με επιλεγμένα υποστρώματα, ταυτοποίησαν το GlcNAc₂ ως το προτιμώμενο υπόστρωμα και για τα δύο ένζυμα αγρίου τύπου. Βασισμένοι στην τρισδιάστατη δομή της BC1534, πραγματοποιήθηκε σειρά πειραμάτων εισαγωγής σχεδιασμένων μεταλλαγών, εστιάζοντας σε κατάλοιπα-κλειδιά. Η αποτελεσματικότητα κατάλυσης των μεταλλαγμάτων ήταν σημαντικά μειωμένη σε σχέση με το ένζυμο αγρίου τύπου. Τέλος, ένα δέντρο βασισμένο στην στοίχιση μεταξύ πρωτεϊνών της LmbE οικογένειας, κατατάσσει τις BC1534 και BC3461 σε διαφορετικές λειτουργικές κατηγορίες από άλλα μέλη.

Φυσική περιγραφή

135 σ. : εικ. ; 30 εκ.

Γλώσσα

Ελληνικά

Θέμα

Basillus anthracis

Basillus cereus

Consensus sequence

GlcNac

LmbE

Κρυσταλλική δομή

Μεταβολικό μονοπάτι