| Περίληψη |
Σκοπός της παρούσης εργασίας ήταν η διερεύνηση της φύσης της πρωτεάσης της LHCII αποπρωτείνης και του ρυθμιστικού της ρόλου στην βιογένεση και λειτουργία της φωτοσυνθετικής μεμβράνης σε φύλλα φασολιού (Phaseolus vulgaris, ποικιλία Red kidney). Η μελέτη αυτή έδειξε ότι: 1. ’θικτοι ωχροπλάστες και χλωροπλάστες παρουσιάζουν πρωτεολυτική ενεργότητα ως προς εξωγενώς προστιθέμενη ή ενδογενή LHCII αποπρωτείνη, αντίστοιχα. Η ενεργότητα αυτή εντοπίζεται κυρίως στο μεμβρανικό κλάσμα και λιγότερο στο κλάσμα του στρώματος, ενώ ο φάκελος (envelope) ώριμων χλωροπλαστών βρέθηκε ότι έχει και αυτός ένα μικρό ποσοστό πρωτεολυτικής ενεργότητας. Έκπλυση των θυλακοειδών με ρυθμιστικό διάλυμα χαμηλής ιοντικής ισχύος (50 mM Tricine-NaOH, pH 7.3), απομακρύνει μερικώς την πρωτεολυτική ενεργότητα, ενώ έκπλυση με 2 M ΝαΒr την απομακρύνει πλήρως από τα θυλακοειδή. Και στις δύο περιπτώσεις τα εκπλύματα παρουσιάζουν ενεργότητα ως προς εξωγενή LHCII. Επομένως, μπορούμε να συμπεράνουμε ότι η πρωτεάση της LHCII αποπρωτείνης είναι μια μεμβρανική πρωτείνη, η οποία προσδένεται περιφερειακά στα θυλακοειδή προς την πλευρά του στρώματος. 2. Κατά την λύση άθικτων χλωροπλαστών παρουσία αυξανόμενων συγκεντρώσεων MgCl2 (0-2 mM), παρατηρήθηκε ότι αύξηση της συγκέντρωσης MgCl2 στο μέσο λύσης προκαλεί μείωση της πρωτεολυτικής ενεργότητας του στρώματος ως προς την εξωγενή LHCII και παράλληλη αύξηση της ενεργότητας των θυλακοειδών ως προς την ενδογενή τους LHCII αποπρωτείνη. Επιπλέον, προσθήκη MgCl2 (μέχρι 2mM) στο μέσο επώασης προκαλεί μικρές μόνο μεταβολές στην ενεργότητα τόσο του στρώματος (μικρή μείωση) όσο και των θυλακοειδών (μικρή αύξηση) συγκριτικά με τις μεταβολές που παρατηρούνται παρουσία ίδιων συγκεντρώσεων MgCl2 στο μέσο λύσης. Επομένως είναι πιθανό, το φαινόμενο αυτό να οφείλεται σε πρόσδεση της πρωτεάσης στα θυλακοειδή παρουσία χαμηλών συγκεντρώσεων MgCl2, με αποτέλεσμα την μείωση της πρωτεολυτικής ενεργότητας του στρώματος. Η συγκέντρωση Mg2+ που απαιτείται για πλήρη πρόσδεση (2 mM) ίσως είναι η απαραίτητη ποσότητα για την εξουδετέρωση των αρνητικών φορτίων στην επιφάνεια των θυλακοειδών και της πρωτεάσης, έτσι ώστε να επικρατήσουν οι ελκτικές δυνάμεις Van der Waals, εφ' όσον υψηλότερες συγκεντρώσεις Mg2+ οδηγούν σε απομάκρυνση της πρωτεάσης και πάλι προς το στρώμα . 3. Η πρωτεολυτική ενεργότητα εξαρτάται από το στάδιο ανάπτυξης του φυτού. Προελασματοειδή σωμάτια χλωρωτικών φυτών ηλικίας 6 ημερών παρουσιάζουν χαμηλή πρωτεολυτική ενεργότητα που αυξάνει παράλληλα με την ανάπτυξη του φυτού. Η εξαρτώμενη από την ηλικία του φυτού αύξηση στην πρωτεολυτική ενεργότητα που παρατηρείται και σε άθικτους ωχροπλάστες, οφείλεται σε ανάλογη αύξηση της ενεργότητας των προθυλακοειδών, εφόσον η πρωτεολυτική ενεργότητα του στρώματος είναι χαμηλή και παραμένει σχεδόν σταθερή καθ' όλη την διάρκεια ανάπτυξης του φυτού. Επομένως η αύξηση που παρατηρούμε δεν οφείλεται σε μεταβαλλόμενη πρόσδεση της πρωτεάσης στα προθυλακοειδή κατά την ανάπτυξη, αλλά πιθανότατα αντικατοπτρίζει την de novo σύνθεση του πρωτεολυτικού συστήματος. 4. Η πρωτεάση των προθυλακοειδών ενεργοποιείται από το φως. Η πρωτεολυτική ενεργότητα (ανά mg πρωτείνης) αυξάνεται μετά από έκθεση των χλωρωτικών φυτών σε δίλεπτη αναλαμπή φωτός. Παρόμοια αύξηση παρατηρείται και σε φυτά που εκθέτονται σε κύκλους περιοδικού φωτισμού, ή σε συνεχή φωτισμό για περιορισμένο χρονικό διάστημα (μέχρι 25 ώρες). Αντίθετα, παρατεταμένη έκθεση σε συνεχή φωτισμό μειώνει την πρωτεολυτική ενεργότητα παράλληλα με την συσσώρευση της χλωροφύλλης. Το φαινόμενο όμως αυτό εξαλείφεται όταν τα θυλακοειδή διαλυτοποιηθούν σε 1% ΤΧ-100. Αντίθετα, η διαλυτοποίηση σε 1% TX-100 των προθυλακοειδών και των πρωτογενών θυλακοειδών δεν επιδρά στην πρωτεολυτική τους ενεργότητα ως προς εξωγενή LHCII αποπρωτείνη. Επιπλέον, η προσθήκη ΤΧ-100 διαλυτοποιημένων ώριμων θυλακοειδών (πλούσιων σε χλωροφύλλη) σε αδιάλυτα πρωτογενή θυλακοειδή δεν έχει καμία επίδραση στην πρωτεολυτική ενεργότητα των δεύτερων. Συμπεραίνουμε επομένως, ότι η μείωση της ενεργότητας στα θυλακοειδή φυτών που εκθέτονται στον συνεχή φωτισμό, οφείλεται σε παρεμπόδιση της πρωτεολυτικής δράσης λόγω οργάνωσης του υποστρώματος και όχι λόγω αναστολής της πρωτεολυτικής δράσης από την χλωροφύλλη. Ο σχηματισμός χλωροφυλλοπρωτεϊνικού συμπλόκου προστατεύει την LHCII αποπρωτείνη από την πρωτεάση. 5. Η πρωτεάση εμπλέκεται στην σταθεροποίηση της LHCII αποπρωτείνης κατά την ανάπτυξη των φυτών σε συνθήκες περιοδικού φωτισμού. Φυτά που εκθέτονται σε περιοδικό φωτισμό και δέχονται τον ίδιο αριθμό αναλαμπών, έχοντας όμως διαφορετική διάρκεια σκοτόφασης (ίδια συσσώρευση χλωροφύλλης, διαφορετικό στάδιο ανάπτυξης), παρουσιάζουν μεγαλύτερη ενεργότητα όσο μεγαλώνει η διάρκεια της σκοτόφασης (περισσότερο αναπτυγμένα). Φυτά που βρίσκονται στην ίδια αναπτυξιακή κατάσταση αλλά έχουν συσσωρεύσει διαφορετικά ποσά χλωροφύλλης έχουν την ίδια περίπου πρωτεολυτική ενεργότητα. Τα παραπάνω αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η πρωτεάση, η οποία μπορεί και δρα σε συνθήκες περιορισμένης συσσώρευσης χλωροφύλλης και εξαρτάται από το στάδιο ανάπτυξης του φυτού, παίζει καθοριστικό ρόλο στην σταθεροποίηση της LHCII αποπρωτείνης. Έτσι μπορεί να δοθεί μία απάντηση στο ερώτημα γιατί τα φυτά που εκτίθενται σε περιοδικό φωτισμό με μικρής διάρκειας σκοτόφαση σταθεροποιούν LHCII αποπρωτείνη (περισσότερο ανεπτυγμένα, μεγαλύτερη πρωτεολυτική ενεργότητα), ενώ αυτά που εκτίθενται σε περιοδικό φωτισμό με μεγάλης διάρκειας σκοτόφαση δεν σταθεροποιούν LHCII αποπρωτείνη (λιγότερο ανεπτυγμένα, μικρότερη πρωτεολυτική ενεργότητα) και έχουν μόνο κέντρα αντίδρασης. 6. Κατά τον έλεγχο της πρωτεολυτικής ενεργότητας των θυλακοειδών ως προς διάφορες πλαστιδιακές και μη πλαστιδιακές πρωτείνες, βρέθηκε ότι στις συνθήκες που εξετάστηκαν αποδομείται έντονα εκτός της LHCII αποπρωτείνης και η POR (οξειδοαναγωγάση της πρωτοχλωροφυλλίδης), γεγονός που οδηγεί στο συμπέρασμα ότι η πρωτεάση αποτελεί έναν ρυθμιστικό μηχανισμό που έχει σαν βασικό στόχο πρωτείνες που προσδένονται με χλωροφύλλη και πρωτοχλωροφύλλη. Αντίθετα η BSA όχι μόνο δεν είναι καλό υπόστρωμα, αλλά δρα και παρεμποδιστικά. 7. Επίδραση in vivo με αναστολείς τόσο πλαστιδιακής (χλωραμφαινικόλη) όσο και κυτταρο-πλασματικής (κυκλοεξιμίδιο) πρωτεϊνικής σύνθεσης έδειξε ότι και τα δύο αντιβιοτικά αναστέλλουν την πρωτεολυτική ενεργότητα, υποδεικνύοντας την πιθανή ύπαρξη πρωτεολυτικού συμπλόκου, του οποίου οι υπομονάδες συντίθενται και στους δύο χώρους, όπως στην περίπτωση της Clp πρωτεάσης, ή κάποιου παράγοντα ενεργοποίησης που συντίθεται σε διαφορετικό χώρο από αυτό της πρωτεάσης. 8. Η φωτοενεργοποίηση της πρωτεολυτικής ενεργότητας που παρατηρείται σε φυτά που εκθέτονται στο φως παρατηρείται και in vitro. Προέκθεση διαλυτοποιημένων σε 1% TX-100 θυλακοειδών σε φως, αυξάνει την πρωτεολυτική ενεργότητα ανάλογα με την ένταση του φωτισμού και την διάρκεια της προέκθεσης στο φως. Το φαινόμενο αυτό ενισχύεται με προσθήκη Mg-ΑΤΡ (5mM), ενώ επιπλέον προσθήκη του αναστολέα φωσφατασών NaF, αναιρεί την ενεργοποιητική δράση του Mg-ΑΤΡ. Μικρή αύξηση παρατηρείται και στην ενεργότητα του στρώματος, ενώ στο έκπλυμα NaBr θυλακοειδών δεν παρατηρείται κάποια επίδραση ούτε από το φως ούτε από το ΑΤΡ. Επομένως είναι πιθανό κάποιος παράγοντας που εντοπίζεται αποκλειστικά στα θυλακοειδή να ενεργοποιείται από το φως και από το ΑΤΡ, ενώ η φωσφορυλιωμένη μορφή της LHCII αποπρωτείνης ή /και της πρωτεάσης να προκαλούν την μείωση της αποδόμησης της LHCII αποπρωτείνης. 9. Προσθήκη ιόντων Mg2+ και Ca2+ στο μέσο επώασης θυλακοειδών αυξάνουν την πρωτεολυτική ενεργότητα, το Ni2+ δεν έχει καμία επίδραση, ενώ τα ιόντα Cu2+, Zn2+ και Cd2+ αναστέλλουν αντίστοιχα λιγότερο ή περισσότερο έντονα την πρωτεολυτική ενεργότητα. Χορήγηση in vivo (με εμβάπτιση) διαλυμάτων Cd2+ (μέχρι 2 mM), σε φυτά που αναπτύσσονται σε συνθήκες περιοδικού φωτισμού προκαλεί μείωση της ποσότητας LHCII που σταθεροποιείται στα πρωτογενή θυλακοειδή. Στις συνθήκες αυτές η πρωτεολυτική ενεργότητα των πρωτογενών θυλακοειδών αναστέλλεται, η συσσώρευση Chl μειώνεται, η ικανότητα πρωτεϊνικής σύνθεσης δεν επηρεάζεται, ενώ ο λόγος σταθεροποιημένης LHCII/Chl παραμένει σταθερός. Βρέθηκε ότι η επίδραση της χορήγησης Cd2+ εκδηλώνεται στο μεταγραφικό στάδιο, προκαλώντας την μείωση του αριθμού των μεταγραφημάτων της LHCII. 10. Η πρωτεάση φαίνεται να εμπλέκεται μερικώς στην διαδικασία αποστοίβαξης των γράνα. Μελέτη της αποστοίβαξης σε διάλυμα χαμηλής ιοντικής ισχύος, σε χλωροπλάστες πριν ή μετά την έκπλυσή τους με 2Μ NaBr, έδειξε ότι η απομάκρυνση της πρωτεάσης από τα θυλακοειδή επηρεάζει μερικώς το φαινόμενο αυτό. Παρόμοια, η προσθήκη του αναστολέα πρωτεασών ΒΑ παρεμποδίζει την αποστοίβαξη και οδηγεί στην σταθεροποίηση των ολιγομερών μορφών του LHCII. Τα αποτελέσματα αυτά οδηγούν στο συμπέρασμα ότι ίσως στα αρχικά στάδια της αποστοίβαξης εμπλέκεται η αποδόμηση της τριμερούς μορφής του LHCII. 11. Η πρωτεολυτική ενεργότητα είναι σταθερή σε υψηλές θερμοκρασίες. Θυλακοειδή που επωάζονται στους 56οC για 98 ώρες χάνουν όλα τα πολυπεπτίδια που ανιχνεύονται σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου με χρώση Coomassie Brilliant Blue, αλλά διατηρούν την ικανότητά τους να ααποδομούν εξωγενώς προστιθέμενη LHCII αποπρωτείνη. Επίσης, η πρωτεολυτική ενεργότητα είναι σταθερή σε χαμηλές συγκεντρώσεις SDS. Κατά την προσπάθεια εμπλουτισμού και απομόνωσης της πρωτεάσης, αναλύθηκαν διάφορα δείγματα σε πηκτή SDS-πολυακρυλαμιδίου και ακολούθησε κλασμάτωση της κάθε διαδρομής. Κατά τον προσδιορισμό της πρωτεολυτικής ενεργότητας ως προς εξωγενή LHCII αποπρωτείνη, εντοπίστηκε ενεργό κλάσμα στην αρχή της πηκτής διαχωρισμού, υποδεικνύοντας την πιθανή ύπαρξη μιας μεγάλου μοριακού βάρους πρωτεάσης. Στην ίδια περιοχή εντοπίστηκε πρωτεολυτική ενεργότητα και με χρήση SDS-πηκτής ενεργότητας. Οι προσπάθειες που έγιναν για περαιτέρω διαχωρισμό της υψηλού μοριακού βάρους πρωτείνης σε ενεργές υπομονάδες δεν είχαν αποτέλεσμα. Επομένως μπορούμε να υποθέσουμε ότι η πρωτεάση που μελετήσαμε είναι μια υψηλού μοριακού βάρους πρωτείνη, ή ένα υπερμοριακό σύμπλοκο, το οποίο δεν μπορεί να διαχωριστεί κάτω από τις συγκεκριμένες συνθήκες που χρησιμοποιήσαμε.
|
Η πρωτεάση των χλωροπλαστών και ο ρόλος της στην αποδόμηση της LHCII αποπρωτεΐνης
