|
|
| Κωδικός Πόρου |
000369221 |
| Τίτλος |
Βιοχημικός χαρακτηρισμός και γενετική ανάλυση του ενζύμου ΒΑ0150 από τον παθογόνο μικροοργανισμό Bacillus anthracis |
| Άλλος τίτλος |
Biochemical characterization and genetic analysis of the enzyme BA0150 from the pathogen microorganism Bacillus anthracis |
|
Συγγραφέας
|
Γκέκας, Σωτήριος
|
|
Σύμβουλος διατριβής
|
Μπουριώτης, Βασίλης
|
| Περίληψη |
Η πεπτιδογλυκάνη αποτελεί τον κυριότερο πολυσακχαρίτη του κυτταρικού τοιχώματος των βακτηρίων και είναι υπεύθυνη για τη σταθερότητα και βιωσιμότητα του βακτηριακού κυττάρου.Είναι ένα πολυμερές που αποτελείται από δύο σάκχαρα, την Ν-ακετυλ-γλυκοζαμίνη (GlcNAc) και το Ν-ακετυλ-μουραμικό οξύ (MurNAc) συνδεδεμένο με μία μικρή ομάδα αμινοξέων. Η πεπτιδογλυκάνη είναι ένα δυναμικό μόριο και έχει κεντρικό ρόλο σε μια σειρά βιολογικών λειτουργιών των βακτηριακών κυττάρων (ανάπτυξη κυττάρων, διαίρεση, αυτόλυση και σπορίωση σε ορισμένα είδη) καθώς και στην παθογένεια, μέσω τροποποιήσεων που υφίσταται κατά τις παραπάνω διαδικασίες. Μια από αυτές τις τροποποιήσεις είναι η απακετυλίωση που πραγματοποιείται από εξειδικευμένα ένζυμα, τις απακετυλάσες πεπτιδογλυκάνης (PDAs). Οι απακετυλάσες πεπτιδογλυκάνης ανήκουν στην οικογένεια εστερασών υδατανθράκων 4 (CE-4 family) και απακετυλιώνουν τα κατάλοιπα Ν-ακετυλ-γλυκοζαμίνης και Ν-ακετυλ-μουραμικού οξέος του επαναλαμβανόμενου δισακχαρίτη της βακτηριακής πεπτιδογλυκάνης.
Ανάλυση του γονιδιώματος του οργανισμού Bacillus anthracis αποκάλυψε την ύπαρξη 11 ανοιχτών πλαισίων ανάγνωσης (ORFs) που κωδικοποιούν για υποθετικές απακετυλάσες πολυσακχαριτών, από τις οποίες 6 είναι υποθετικές απακετυλάσες Ν-ακετυλ-γλυκοζαμίνης της πεπτιδογλυκάνης και οι υπόλοιπες 5 υποθετικές απακετυλάσες πολυσακχαριτών. Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η μελέτη του ενζύμου ΒΑ0150 από τον παθογόνο μικροοργανισμό B. anthracis. Το συγκεκριμένο ένζυμο ανήκει στην κατηγορία των υποθετικών απακετυλασών πολυσακχαριτών και εμφανίζει 61% ταυτότητα με το ένζυμο PdaB, μία υποθετική απακετυλάση πολυσακχαριτών από τον οργανισμό B. subtilis που σχετίζεται με τη σπορίωση.
Στην παρούσα μελέτη πραγματοποιήθηκε κλωνοποίηση του γονιδίου ba0150 σε κατάλληλο πλασμιδιακό φορέα (pET26b) και ακολούθησε μετασχηματισμός κυττάρων E. coli, με αποτέλεσμα την υπερπαραγωγή της πρωτεΐνης μετά από επαγωγή. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε η απομόνωση του ενζύμου σε δύο χρωματογραφικά στάδια, χρησιμοποιώντας προσροφητές Ni-ΝΤΑ agarose και μοριακής διήθησης Sephacryl S200 HR. Ακολούθησαν προκαταρκτικά πειράματα βιοχημικού χαρακτηρισμού με χρήση ραδιοσημασμένων υποστρωμάτων γλυκολ-χιτίνης, καθώς και Ν-ακετυλοχιτοολιγομερών. Ωστόσο, το ένζυμο δεν παρουσίασε ενεργότητα σε κανένα από τα παραπάνω υποστρώματα.
Προκειμένου να διαλευκανθεί ο βιολογικός ρόλος του ενζύμου, πραγματοποιήθηκαν πειράματα γενετικής ανάλυσης (με τη μέθοδο απενεργοποίησης του γονιδίου) και κυτταρικού εντοπισμού. Μέχρι στιγμής απομονώθηκε στέλεχος του B. anthracis μόνο με απλό ανασυνδυασμό. Το συγκεκριμένο στέλεχος παρουσίασε φαινότυπο πολύ διαφορετικό σε σχέση με αυτό του αγρίου τύπου. Τα βλαστητικά κύτταρα του μεταλλάγματος εμφάνισαν πιο επιμηκυσμένες αλυσίδες ενώ το σχήμα τους ήταν παραλλαγμένο (καμπυλωτό) σε σχέση με τα αντίστοιχα του αγρίου τύπου. Επίσης, το μετάλλαγμα εμφάνισε ανθεκτικότητα στη δράση της λυσοζύμης αλλά ευαισθησία στη μουτανολυσίνη.
Λαμβάνοντας υπ’ όψιν το ενδιαφέρον που υπάρχει για τον B. anthracis ως ένα επικίνδυνο βιολογικό όπλο, η παρούσα μελέτη μπορεί να αποτελέσει βάση για το σχεδιασμό φαρμάκων τα οποία θα στοχεύουν ένζυμα που λαμβάνουν μέρος στη βιοσύνθεση και την τροποποίηση των πολυσακχαριτών του B. anthracis.
|
| Φυσική περιγραφή |
69 σ. : χάρτ., πίν., έγχ. εικ. ; 30 εκ. |
| Γλώσσα |
Ελληνικά |
| Θέμα |
Deacetylates |
|
Peptidoglycan |
|
Peptidoglycan polysacchacharide |
|
Απακετυλάσες πεπτιδογλυκάνης |
|
Απακετυλάσες πολυσακχαριτών |
|
Πεπτιδοκλυκάνη |
| Ημερομηνία έκδοσης |
2011-11-18 |
| Συλλογή
|
Σχολή/Τμήμα--Σχολή Θετικών και Τεχνολογικών Επιστημών--Τμήμα Βιολογίας--Μεταπτυχιακές εργασίες ειδίκευσης
|
|
|
Τύπος Εργασίας--Μεταπτυχιακές εργασίες ειδίκευσης
|
| Εμφανίσεις |
272 |
Βιοχημικός χαρακτηρισμός και γενετική ανάλυση του ενζύμου ΒΑ0150 από τον παθογόνο μικροοργανισμό Bacillus anthracis
