| Περίληψη |
Η επίκτητη έλλειψη διακριτών ενδιάμεσων περιοχών του μακρού βραχίονα του χρωμοσώματος 5 αποτελεί μία από τις συχνότερες κυτταρογενετικές ανωμαλίες που απαντώνται στους ασθενείς με προλευχαιμικές και λευχαιμικές διαταραχές. Ένας μεγάλος αριθμός γονιδίων που κωδικοποιούν αιμοποιητικούς αυξητικούς παράγοντες, υποδοχείς αυξητικών παραγόντων ή άλλα ρυθμιστικά μόρια, έχει χαρτογραφηθεί στην περιοχή 5q23-31, η οποία συχνά εξαλείφεται στους ασθενείς με μυελοδυσπλαστικά σύνδρομα. Η συγκέντρωση μίας ποικιλίας γονιδίων που εμπλέκονται στην αιμοποίηση και στην κυτταρική αύξηση και διαφοροποίηση γενικότερα, οδήγησε σε εκτεταμένες έρευνες σχετικά με το ρόλο της περιοχής στην παθογένεση των μυελοδυσπλαστικών συνδρόμων. Ωστόσο, οι μακροχρόνιες προσπάθειες δεν αποκάλυψαν κανένα γονίδιο υπεύθυνο για τα μυελοδυσπλαστικά σύνδρομα και την εξέλιξή τους σε οξεία μυελογενή λευχαιμία.
Ανεξάρτητες κυτταρογενετικές μελέτες δειγμάτων πληροφοριακών ασθενών υπέδειξαν την ύπαρξη μικρότερων δυνητικά “κρίσιμων” υποπεριοχών εντός της “κρίσιμης” περιοχής 5q23-31. Ο σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η δημιουργία ενός φυσικού και μεταγραφικού αιμοποιητικού χάρτη της μίας από τις “κρίσιμες” υποπεριοχές της 5q23-31 και η ανίχνευση νέων γονιδίων που σχετίζονται με τη φυσιολογική αιμοποίηση και δυνητικά με τη λευχαιμογένεση.
Με βάση τoν ανωτέρω σκοπό, αρχικά κατασκευάστηκε ο φυσικός χάρτης της μίας από τις “κρίσιμες” υποπεριοχές που περιλαμβάνει τα γονίδια της ιντερλευκίνης-3 (IL-3), του αυξητικού παράγοντα των κοκκιοκυττάρων-μακροφάγων (GM-CSF), του παράγοντα που ρυθμίζει τα γονίδια των ιντερφερονών τύπου 1 (IRF1) και του ειδικού μεταγραφικού παράγοντα των Τ-λεμφοκυττάρων 1 (TCF-1). Συγκεκριμένα, η μοριακή σάρωση κλώνων YACs των βιβλιοθηκών CEPH και ICI και κλώνων PΑCs της βιβλιοθήκης RPCI1 με την εφαρμογή της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR), οδήγησε στην ανίχνευση γενωμικών κλώνων που χαρακτηρίστηκαν περαιτέρω με τη χαρτογράφηση STSs και την εφαρμογή της Alu-PCR. Η σειρά των αλληλοεπικαλυπτόμενων κλώνων (contig) που προέκυψε εκτείνεται σε μία περιοχή περίπου 3 Mb.
Προκειμένου να κατασκευαστεί ο μεταγραφικός χάρτης της υπό εξέταση περιοχής, επιλέχθηκαν γνωστά γονίδια και εκφραζόμενες αλληλουχίες ESTs που προέρχονταν από αιμοποιητικούς ιστούς. Η ανάλυση των κλώνων YACs σε συνδυασμό με τη συγκριτική μελέτη του γονιδιώματος του ανθρώπου και του ποντικού in silico, οδήγησε σε ένα πλήρη αιμοποιητικό χάρτη της περιοχής που παρουσιάζει αξιόλογη συγγραμμικότητα με τις περιοχές 11B1.3, 18D3 και 13B1 του ποντικού.
Αφού πιστοποιήθηκε η έκφραση των επιλεγμένων ESTs στο μυελό των οστών, ακολούθησε η επέκταση της αλληλουχίας τους με την εφαρμογή της RACE-PCR σε βιβλιοθήκες cDNA μυελού των οστών και εμβρυϊκού ήπατος και προσδιορισμός της αλληλουχίας των αντίστοιχων κλώνων cDNA I.M.A.G.E. Επιπλέον, με την εφαρμογή του συνόλου των υπολογιστικών προγραμμάτων ΝΙΧ, αναλύθηκαν τρεις γενωμικοί κλώνοι Ρ1 (AC005221, AC004507, AC006077) ως προς την παρουσία δυνητικών εξωνίων και γονιδίων. Ορισμένα δυνητικά εξώνια επεκτάθηκαν με την εφαρμογή της RACE-PCR σε βιβλιοθήκες cDNA των λευκοκυττάρων και της καρδιάς. Ακολούθησε ανάλυση της έκφρασης των αλληλουχιών που προέκυψαν, με PCR σε μία σειρά βιβλιοθηκών cDNA και ανάλυση τύπου Νorthern.
Η ανάλυση του γενωμικού κλώνου AC006077 οδήγησε στην απομόνωση του γονιδίου μίας δισουλφιδικής ισομεράσης (C5orf14) από τις βιβλιοθήκες cDNA των λευκοκυττάρων και του μυελού των οστών. Η έκφραση του γονιδίου ανιχνεύτηκε επιπλέον στον πλακούντα, στo πάγκρεας, στο ήπαρ, στην καρδιά, στον εγκέφαλο, στον πνεύμονα, στoν νεφρό, στον σκελετικό μυ, στο λεπτό και στο παχύ έντερο, στον σπλήνα, στον θύμο αδένα. Επίσης, διαπιστώθηκε ότι το παρακείμενο τελομερικό γονίδιο ενός συμπαράγοντα διμερισμού του HNF-1α (PCBD2) εκφράζεται στα λευκοκύτταρα και το μυελό των οστών.
Το επιστέγασμα της παρούσας μελέτης ήταν η ανακάλυψη ενός νέου κεντρομερικού γονιδίου του κλώνου AC006077 από τις βιβλιοθήκες cDNA της καρδιάς και των λευκοκυττάρων. Συγκεκριμένα, η εφαρμογή της κλασικής και της RACE-PCR είχε ως αποτέλεσμα την απομόνωση δύο εναλλακτικών μεταγράφων. Το μετάγραφο FLJ37562 περιλαμβάνει δύο εξώνια και κωδικοποιεί μία υποθετική πρωτεΐνη 188 αμινοξέων, ενώ το AJ437658 περιλαμβάνει τρία εξώνια και κωδικοποιεί μία υποθετική πρωτεΐνη 155 αμινοξέων. Οι δύο ισομορφικές πρωτεΐνες διαφέρουν στο καρβοξυτελικό τους άκρο. Η ανάλυση της έκφρασης του γονιδίου έδειξε ότι ανιχνεύεται επιπλέον στο μυελό των οστών, στον σκελετικό μυ, στο ήπαρ, στον πλακούντα και στον νεφρό. Η μελέτη ολοκληρώθηκε με την απομόνωση του ομόλογου γονιδίου του ποντικού από βιβλιοθήκη cDNA εμβρύου 17 ημερών. Το μετάγραφο AJ492504 του ποντικού επίσης περιλαμβάνει δύο εξώνια και κωδικοποιεί μία υποθετική πρωτεΐνη 188 αμινοξέων. Με ανάλυση τύπου Νorthern ανιχνεύτηκε η έκφρασή του στην καρδιά, στο ήπαρ, στον εγκέφαλο, στον νεφρό, στον όρχι, στον σπλήνα και στον πνεύμονα.
Το νέο γονίδιο παρουσιάζει αξιοσημείωτη ομοιότητα στο επίπεδο του mRNA και των κωδικοποιούμενων πρωτεϊνών με πολλά είδη θηλαστικών, αλλά και με το κοτόπουλο, αμφίβια και ιχθείς. Οι δύο ισομορφικές πρωτεΐνες του ανθρώπου και η ομόλογη του ποντικού διαθέτουν σήμα πυρηνικής εντόπισης. Διαθέτουν ενδιάμεσα τμήματα που παρουσιάζουν μέτρια ομοιότητα με δομικά και λειτουργικά μόρια πλέον εξελιγμένων αλλά και κατώτερων οργανισμών. Το γεγονός ότι το γονίδιο εκφράζεται ήδη από τα αρχικά στάδια της οντογένεσης του ποντικού και η έκφρασή του διατηρείται σε πληθώρα οργάνων κατά την ενήλικη ζωή, υποδεικνύει ότι παίζει βασικό ρόλο στην ανάπτυξη και τη λειτουργία του οργανισμού. Τα ανωτέρω δεδομένα της παρούσας διατριβής προσφέρουν τη δυνατότητα για περαιτέρω μελέτες με στόχο την ανάδειξη του λειτουργικού ρόλου των γονιδίων αυτών, αλλά και της ευρύτερης περιοχής 5q23-31, στη φυσιολογική αιμοποίηση και τη λευχαιμογένεση.
|
Κατασκευή φυσικού και αιμοποιητικού μεταγραφικού χάρτη της περιοχής 5q23-31 του ανθρώπου - απομόνωση και χαρακτηρισμός ενός νέου γονιδίου και του ομολόγου του στον ποντικό
