| Περίληψη |
Εισαγωγή H ανοσοδιαγνωστική μέθοδος πόλωσης φθορισμού (FPIA) είναι μια ομογενής, πολύ απλή στην εκτέλεση της μέθοδος με πολλές εφαρμογές στην ανάλυση βιολογικά ενεργών ουσιών. Η έρευνα για τη βελτιστοποίηση της FPIA και την ανάπτυξη νέων συστημάτων πόλωσης φθορισμού έχει ενταθεί τα τελευταία χρόνια με σκοπό την εφαρμογή της μεθόδου στην περιβαλλοντική ανάλυση. Οι δυσκολίες που αντιμετωπίζονται είναι πολλές λαμβανομένου υπόψιν του πλήθους των τοξικών ουσιών αλλά και των διαφορετικών απαιτήσεων κάθε αναλυτικής διαδικασίας. H πολυπλοκότητα των δειγμάτων προς ανάλυση και η επίδραση του υποστρώματος του δείγματος στο αποτέλεσμα επιβάλει σε πολλές περιπτώσεις την προκατεργασία του δείγματος με αρνητικές συνέπειες στην ευκολία εκτέλεσης και την ταχύτητα. Επίσης οι ομογενείς ανοσοδιαγνωστικές μέθοδοι συχνά υποφέρουν από χαμηλή ευαισθησία και από διασταυρούμενες αντιδράσεις με συνέπεια τα αποτελέσματα πολλές φορές να αλλοιώνονται. Oι αναλυτικές μέθοδοι αναφοράς στην περιβαλλοντική ανάλυση είναι χρωματογραφικές (HPLC, GC, GC-MS), περιλαμβάνουν χρονοβόρα βήματα εκχύλισης, καθαρισμού συγκέντρωσης και εμπλουτισμού των δειγμάτων, είναι ακριβές (διαλύτες, πρότυπα διαλύματα, λειτουργία και συντήρηση μηχανημάτων κλπ), απαιτούν απόλυτα εξειδικευμένο προσωπικό, ενώ σε ορισμένες περιπτώσεις δεν ενδείκνυται η χρήση τους. Οι βασικές προϋποθέσεις για την πιο ευρεία εφαρμογή των ανοσοδιαγνωστικών μεθόδων γρήγορου ελέγχου, για προσδιορισμό τοξικών ουσιών σε συνδυασμό με τις μεθόδους αναφοράς ενόργανης ανάλυσης είναι η απλοποίηση, η συντόμευση, η μείωση των ορίων ανίχνευσης και η βελτίωση της αξιοπιστίας τους. H ανοσοδιαγνωστική μέθοδος πόλωσης φθορισμού (FPIA) μπορεί να ικανοποιήσει όλες αυτές τις απαιτήσεις γι'αυτό και είναι απαραίτητη η έρευνα για την Για τις ανάγκες της παρούσας διατριβής χρησιμοποιήθηκαν σαν μοντέλα τα ζιζανιοκτόνα 2,4 διχλωροφαινοξυ οξικό οξύ (2,4D) και 2,4,5 τριχλωροφαινοξυ οξικό οξύ (2,4,5Τ). Με βάση αυτά τα μόρια συντέθηκαν ανοσογόνα και νέα φθορίζοντα αντιγόνα και μελετήθηκε η επίδραση τους στα χαρακτηριστικά της FPIA. Η σταθερή βελτίωση της ευαισθησίας που παρατηρήθηκε ανεξάρτητα από το είδος του αντιγόνου οδήγησε στον καθορισμό νέων συνθηκών και υλικών που βελτιώνουν Aρχή της ανοσοδιαγνωστικής μεθόδου πόλωσης φθορισμού Η FPIA χρησιμοποιεί δύο τεχνολογίες α) την ανταγωνιστική δέσμευση του αντιγόνου από το αντίσωμα και β) την πόλωση φθορισμού. Αυτή βασίζεται στην αρχή ότι τα μόρια περιστρέφονται στο διάλυμα και η ταχύτητα περιστροφής τους σχετίζεται με το μέγεθος των μορίων. Ελεύθερα μόρια φθορίζοντος ανιχνευτή απορροφούν κάθετα πολωμένο φως. Λόγω του μικρού μεγέθους τους περιστρέφονται γρήγορα και καθώς αλλάζουν προσανατολισμό εκπέμπουν μη πολωμένο φως (μικρή πόλωση φθορισμού). Αντίθετα, δεσμευμένα από το αντίσωμα μόρια ανιχνευτή περιστρέφονται αργά λόγω του μεγάλου μεγέθους τους. Παραμένουν σχεδόν με ίδιο προσανατολισμό και συνεπώς εκπέμπουν σχεδόν πολωμένο φως (μεγάλη πόλωση φθορισμού). Η ύπαρξη ή όχι αντιγόνου στο δείγμα προς ανάλυση, οδηγεί σε μικρή ή μεγάλη πόλωση φθορισμού αντίστοιχα, λόγω της ανταγωνιστικής δέσμευσης του αντιγόνου και του ανιχνευτή στις θέσεις του αντισώματος. Πειραματικό μέρος Σύνθεση ανοσογόνων, ανοσοποιήσεις - αντισώματα: Το 2,4,5Τ συνδέθηκε με την BSA είτε χωρίς γέφυρα, είτε χρησιμοποιώντας την β-Αλανίνη ή το ε-Αμινοκαπροϊκό οξύ σα χημική γέφυρα. Τα ανοσογόνα που συντέθηκαν ήταν 2,4,5Τ-BSA, 2,4,5T-βAla-BSA και 2,4,5T-εAca- BSA. Ανοσοποιήθηκαν πειραματόζωα (κουνέλια Νέας Ζηλανδίας), οι αντιορροί που παρήχθησαν κατεργάσθηκαν με θειικό αμμώνιο για την απομόνωση των ανοσοσφαιρινών και χρησιμοποιήθηκαν σε συγκριτικές μελέτες με άλλους αντιορρούς. Για τη μέτρηση του 2,4D χρησιμοποιήθηκε το μονοκλωνικό αντίσωμα E2/G2 το οποίο έχει χρησιμοποιηθεί και από άλλους ερευνητές σε ανοσοδιαγνωστικά συστήματα. Σύνθεση ανιχνευτών: Χρησιμοποιώντας χημεία στερεής φάσης, αναπτύχθηκε μέθοδος σύνθεσης απτενίων με την οποία παρασκευάστηκαν μια σειρά από μονοσημασμένοι και πολυσημασμένοι με FITC ανιχνευτές υψηλής καθαρότητας. Σα χημική γέφυρα χρησιμοποιήθηκε η L-λυσίνη σε διαφορετικούς προσανατολισμούς. Απομονώθηκαν με παρασκευαστική χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας και η δομή τους επιβεβαιώθηκε με UV και NMR. Επίσης παρασκευάστηκαν ανιχνευτές που προτείνονται από άλλους ερευνητές και συγκρίνονται όσον αφορά την αποτελεσματικότητα τους στην FPIA. Για την επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων συντέθηκαν επίσης αντίστοιχοι ανιχνευτές με τα αντιγόνα ενδοσουλφάν και ινδομεθακίνη. Εκτέλεση της FPIA: Οι μετρήσεις έγιναν στον αναλυτή TDx Abbot στην λειτουργία photocheck. Κατασκευάστηκαν καμπύλες για την τιτλοδότηση των αντιορρών και πρότυπες καμπύλες χρησιμοποιώντας σταθερά διαλύματα αντιγόνου. Η ευαισθησία εκτιμήθηκε με την μέτρηση της τιμής Ι50 (η συγκέντρωση του αντιγόνου που δίδει 50% μείωση στην πόλωση φθορισμού) ενώ επίσης μετρήθηκαν τα ποσοστά των διασταυρούμενων αντιδράσεων με χημικά παρόμοιες ουσίες. Ακόμα εκτιμήθηκαν παράμετροι όπως η ανάκτηση, η ακρίβεια και η επαναληψιμότητα σε δείγματα εμφιαλωμένου νερού στα οποία προηγουμένως είχε προστεθεί ορισμένη ποσότητα αντιγόνου. Επίσης προτείνομε την χρήση του λόγου *B/*F σαν τεταγμένη για την κατασκευή πρότυπων καμπυλών. Οι σταθερές σύνδεσης του αντισώματος Ε2/G2 με τους ανιχνευτές αλλά και με το 2,4D υπολογίστηκαν με ανάλυση Scatchard. Αποτελέσματα - Συμπεράσματα ομή ανιχνευτών και ευαισθησία: Η L-λυσίνη έδωσε τη δυνατότητα να συντεθούν ανιχνευτές σε μεγάλη ποικιλία (μονοσημασμένοι ή πολυσημασμένοι, ομόλογοι ή ετερόλογοι ως προς το ανοσογόνο) και να γίνει μια ολοκληρωμένη μελέτη της επίδρασης της δομής τους στην αποτελεσματικότητα της μεθόδου. Από τα αποτελέσματα των μετρήσεων προκύπτει κατ'αρχάς ότι σε συμβατική FPIA δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν πολυσημασμένοι ανιχνευτές λόγω της εμφάνισης σημαντικής αυτοαπόσβεσης φθορισμού. Η ένταση του φαινομένου αυτού αποδεικνύεται ότι εξαρτάται από τη στερεοχημεία του μορίου, όμως σε καμμία περίπτωση δισημασμένου ανιχνευτή δεν είχαμε καλύτερη ευαισθησία σε σχέση με τους μονοσημασμένους λόγω της εμφάνισης και φαινομένου προπέλας. Κατά τη δέσμευση των μονοσημασμένων ανιχνευτών στο αντίσωμα υπάρχει απόσβεση φθορισμού που οφείλεται στην αλληλεπίδραση της φθορίζουσας ουσίας με την περιοχή δέσμευσης. Αυτή η αλληλεπίδραση μεγαλώνει καθώς μικραίνει το μήκος της χημικής γέφυρας, ελλατώνεται το φαινόμενο προπέλας και αυξάνεται η πόλωση φθορισμού. Όταν το αντιγόνο συνδέεται στην α-αμινομάδα της L-λυσίνης και το φθορίζον μόριο στην ε-αμινομάδα (Ag-K(F)-OH) προκύπτουν ανιχνευτές με βελτιωμένα χαρακτηριστικά προσδίδοντας στη μέθοδο χαμηλώτερα όρια ανίχνευσης και τιμές Ι50 τέσσερις έως εννέα φορές χαμηλώτερες από αυτές που αναφέρονται στη βιβλιογραφία. Όταν χρησιμοποιήθηκε ο ανιχνευτής 2,4D-K(F)-OH σε συνδυασμό με το αντίσωμα Ε2/G2 το Ι50 ήταν 12 ng/ml, ενώ όταν ο ανιχνευτής έχει σαν γέφυρα τη αιθυλενοδιαμίνη (2,4D-EDA-F) το Ι50 που αναφέρεται στην βιβλιογραφία είναι μεταξύ 80 και 100 ng/ml. Το Ι50 με τον ισομερή ανιχνευτή (F-K(2,4D)-OH) μετρήθηκε 93,5 ng/ml, ενώ όταν χρησιμοποιήθηκε ο ανιχνευτής που προτείνεται από άλλους ερευνητές 2,4D-EDA-F, αυτό ήταν 65ng/ml. Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρούνται όταν για την σύνθεση ανιχνευτών χρησιμοποιούνται και άλλα αντιγόνα (2,4,5Τ, ενδοσουλφάν, ινδομεθακίνη). Από την Scatchard ανάλυση προέκυψε ότι η σταθερά σύνδεσης του ανιχνευτή 2,4D-EDA-F με το αντίσωμα ήταν περίπου μια τάξη μεγέθους μεγαλύτερη από την αντίστοιχη του 2,4D-K(F)- OH. Συμπεραίνεται ότι η ιδιαιτερότητα της δομής Αg-K(F)-OH δημιουργεί συνθήκες πιο ειδικής αναγνώρισης της από το αντίσωμα με συνέπεια την σημαντικά αυξημένη ευαισθησία σε σχέση με οποιαδήποτε άλλη δομή που χρησιμοποιήθηκε. Αλλα χαρακτηριστικά της μεθόδου: Η χρησιμοποίηση των νέων ευαίσθητων μορίων αφήνει σχεδόν ανεπηρέαστη την ειδικότητα των μετρήσεων αφού οι διασταυρούμενες αντιδράσεις παραμένουν όπως ήδη έχουν αναφερθεί στην βιβλιογραφία. Η ανάκτηση της μεθόδου κυμαίνεται σε φυσιολογικά επίπεδα από 90-110%, ενώ ο συντελεστής μεταβλητότητας ήταν μικρότερος από 7%. Το όριο ανίχνευσης για το 2,4D προσδιορίστηκε στα 0,8 ng/ml. Μια άλλη σημαντική προσέγγιση είναι η χρησιμοποίηση του λόγου του δεσμευμένου προς τον ελεύθερο ανιχνευτή (*B/*F) αντί της πόλωσης, σαν αναλυτική παράμετρο στις πρότυπες καμπύλες. Τα πλεονεκτήματα ήταν: η σημαντική μείωση και σταθερότητα των Ι50 και η σταθερότητα των πρότυπων καμπυλών. Το όριο ανίχνευσης με αυτή την προσέγγιση ήταν μικρότερο από τα 0,35 ng/ml. Αντισώματα και ευαισθησία: Τα αποτελέσματα που αναφέρονται πιο πάνω επαναλαμβάνονται χωρίς να επηρεάζονται από το είδος του αντισώματος (μονοκλωνικό ή πολυκλωνικό). Η επίδραση της δομής του αντιγόνου ήταν σημαντική στην ποιότητα του αντισώματος. Αντισώματα που παρουσίασαν την μεγαλύτερη ευαισθησία σε συνδυασμό με τους ανιχνευτές Ag-K(F)-OH αντιστοιχούν σε αντιγόνα με τη χημική γέφυρα των τριών ατόμων άνθρακα βAla. Ανάπτυξη της FPIA ενιαίου αντιδραστηρίου Η μέθοδος απλοποιείται ακόμη περισσότερο καθώς το αντίσωμα σταθεροποιείται όταν αναμιχθεί στην αραίωση εργασίας του με τον ανιχνευτή. Το μίγμα αντισώματος-ανιχνευτή αποτελεί το ενιαίο αντιδραστήριο. Σ' αυτό προστίθεται το προς ανάλυση δείγμα και η μέτρηση λαμβάνεται σε 5 - 10 λεπτά αφού έχει πια αποκατασταθεί ισορροπία. Η FPIA ενιαίου αντιδραστηρίου έχει τα εξής χαρακτηριστικά: α) Ουσιαστικά αποτελεί μέθοδο ενός βήματος. β) Το ενιαίο αντιδραστήριο σε συμπυκνωμένη μορφή 30 φορές μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τουλάχιστον 4 μήνες και έχει αυξημένη σταθερότητα έναντι των συστατικών του πριν την ανάμιξη. γ) Τα αποτελέσματα όσον αφορά τα Ι50 είναι απολύτως συγκρίσιμα με αυτά που λήφθησαν με τη συμβατική FPIA αφού σε όλες τις μετρήσεις ήταν 10 - 12 ng/ml. δ) Η απλούστευση στην εκτέλεση και τα λιγότερα στάδια προσθήκης αντιδραστηρίων ελλατώνουν τις τυπικές αποκλίσεις. Αποτέλεσμα είναι η μείωση των ορίων ανίχνευσης σε σχέση με τη συμβατική FPIA, τα οποία σε όλες τις μετρήσεις για το 2,4D με τεταγμένη πόλωση βρέθηκαν μικρότερα από 0,8 ng/ml. Γενικά συμπεράσματα Η χρησιμοποίηση χημείας στερεής φάσης αποδεικνύεται ότι είναι ένα πολύ χρήσιμο εργαλείο για την σύνθεση απτενίων σε ανοσοδιαγνωστικές μεθόδους. Η αρνητική επίδραση της αυτοαπόσβεσης στους πολυσημασμένους ανιχνευτές και κυρίως το φαινόμενο προπέλας δεν επιτρέπουν την χρήση τους σε συμβατική FPIA. Χρησιμοποιήθηκε για πρώτη φορά L-λυσίνη σαν γέφυρα για μονοσημασμένους ανιχνευτές οι οποίοι ήταν σχεδόν δέκα φορές πιο ευαίσθητοι σε σχέση με άλλους που αναφέρονται στην βιβλιογραφία. Αυτοί οι ανιχνευτές αναγνωρίζονταν ειδικά από το αντίσωμα. Χρησιμοποιώντας το ενιαίο αντιδραστήριο και τον λόγο *B/*F σαν αναλυτική παράμετρο η μέθοδος απλοποιήθηκε ακόμη περισσότερο και το όριο ανίχνευσης πλησίασε τα ευρωπαϊκά MRLs. Τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής οδήγησαν σε σημαντικές και βασικές παρεμβάσεις στην FPIA με αποτέλεσμα τη βελτίωση των χαρακτηριστικών της και κυρίως της ευαισθησίας. Προτείνονται ανιχνευτές με συγκεκριμένη δομή και συγκεκριμένο τρόπο σύνθεσης που μπορούν να εφαρμοστούν σχεδόν σε όλα τα αντιγόνα. Η ανάλυση τοξικών ουσιών με την FPIA έγινε σχεδόν μια τάξη μεγέθους πιο ευαίσθητη αποτελώντας ένα σημαντικό εργαλείο για την τοξικολογική ανάλυση.
|
Ανάπτυξη ανοσοδιαγνωστικών μεθόδων πόλωσης φθορισμού για τον προσδιορισμό τοξικών ουσιών
