Your browser does not support JavaScript!

Αρχική    Towards more active and stable BVMOs via protein engineering  

Αποτελέσματα - Λεπτομέρειες

Προσθήκη στο καλάθι
[Προσθήκη στο καλάθι]
Κωδικός Πόρου 000461904
Τίτλος Towards more active and stable BVMOs via protein engineering
Άλλος τίτλος Στοχεύοντας σε πιο ενεργές και σταθερές μονοοξυγενάσες μέσω πρωτεϊνικής μηχανικής
Συγγραφέας Μιχαλοπούλου, Χριστίνα Δ.
Σύμβουλος διατριβής Παυλίδης, Ιωάννης
Μέλος κριτικής επιτροπής Παυλίδης, Παύλος
Ελευθεριάδης, Νικόλαος
Περίληψη Οι Baeyer-Villiger μονοοξυγενάσες (BVMOs, EC 1.14.13.X) προσφέρουν μία «πράσινη» εναλλακτική για τη σύνθεση λακτονών από κετόνες. Στα μειονεκτήματά τους είναι η αστάθεια που παρουσιάζουν κάτω από συνθήκες θερμικού και οξειδωτικού στρες. Μία επιπλέον πρόκληση κατά τη διεργασία των BVMOs είναι η παραγωγή του H2O2 αντί του σχηματισμού προϊόντος μέσω ενός κύκλου αντίδρασης αποσύζευξης ή όπως αναφέρεται στην βιβλιογραφία, αντίδρασης uncoupling. Η μελέτη αυτή εστιάζει στην προσπάθεια σταθεροποίησης της 2-oxo-D3-4,5,5-trimethylcyclopentenylacetylCoA μονοοξυγενάσης που προέρχεται από το βακτήριο Pseudomonas putida (OTEMO). Ως πρώτη προσέγγιση της ομάδας μας αποτέλεσε η χρήση της στρατηγικής του ορθολογικού σχεδιασμού μεταλλάξεων. Στόχος της μεταλλαξιγένεσης αποτέλεσαν τα αμινοξέα του ενεργού κέντρου τα οποία είναι επιρρεπή στην οξείδωση και συγκεκριμένα η κυστεΐνη στη θέση 444 μεταλλάχθηκε σε σερίνη. Αυτή η προσπάθεια βελτίωσε την θερμική σταθερότητα και αύξησε την ειδική ενεργότητα του ενζύμου κατά 1.5 φορά σε σχέση με την ΟΤΕΜΟ αγρίου τύπου. Ταυτόχρονα, όμως, το μετάλλαγμα εμφάνισε μειωμένη οξειδωτική σταθερότητα και αυξημένο ποσοστό uncoupling. Για τον περιορισμό αυτών των μειονεκτημάτων, στην παρούσα μεταπτυχιακή εργασία έγινε χρήση της στρατηγικής της κατευθυνόμενης εξέλιξης μέσω τυχαίας εισαγωγής μεταλλάξεων και συγκεκριμένα με επιρρεπή-στα-λάθη αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (epPCR). Η μεταλλαξιγένεση αυτή πραγματοποιήθηκε στην ΟΤΕΜΟ_C444S, ως σταθερότερο ικρίωμα το οποίο είναι πιθανότερο να βελτιστοποιηθεί περαιτέρω οδηγώντας σε νέα λειτουργικά μεταλλάγματα. Για το σκοπό αυτό, δημιουργήθηκαν αρκετές βιβλιοθήκες μεταλλαγμάτων και επιλέχθηκε η βέλτιστη έπειτα από αξιολόγηση. Από αυτήν, ~800 κλώνοι ελέγχθηκαν για αυξημένη ενεργότητα και σταθερότητα έναντι του H2O2 και εντοπίστηκαν μεταλλάγματα με βελτιωμένο επίπεδο έκφρασης (κατά 1.5 με 3 φορές) και αυξημένη οξειδωτική σταθερότητα. Το μετάλλαγμα OTEMO_C444S/K155E έδειξε την μεγαλύτερη βελτίωση όσον αφορά την οξειδωτική σταθερότητα διατηρώντας την ενεργότητά του κατά 20% περισσότερο σε τελικές συγκεντρώσεις 5- 25 mM H2O2 σε σχέση με την ΟΤΕΜΟ_C444S. Ωστόσο, η θερμική του σταθερότητα μειώθηκε αφού μετά από 24 ώρες στους 35℃ δεν ήταν ενεργό. Επιπλέον το μετάλλαγμα OTEMO_C444S/D375G έδειξε μείωση στο ποσοστό uncoupling κατά 3 φορές σε σχέση με την ΟΤΕΜΟ_C444S, χωρίς όμως να έχει τη μεγαλύτερη βελτίωση στον έλεγχο της οξειδωτικής σταθερότητας. Η παρατήρηση αυτή δεν δείχνει την άμεση συσχέτιση μεταξύ του ποσοστού uncoupling και της οξειδωτικής σταθερότητας. Και οι 2 θέσεις μεταλλαξιγένεσης βρίσκονται μακριά από το ενεργό κέντρο του ενζύμου. Τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαίωσαν ότι η epPCR ήταν ένα αποτελεσματικό εργαλείο για την εύρεση απομακρυσμένων μεταλλάξεων από το ενεργό κέντρο για την σταθεροποίηση βιομηχανικών ενζύμων, κάτι το οποίο δύσκολα θα μπορούσε να επιτευχθεί με τον ορθολογικό σχεδιασμό μεταλλάξεων.
Φυσική περιγραφή 74 σ. : πίν., σχήμ., εικ. (μερ. εγχρ.) ; 30 εκ.
Γλώσσα Αγγλικά
Θέμα Error-prone PCR
Monooxygenases
Stability
Thermal stability
Επιρρεπή-στα-λάθη αλυσιδωτή αντίδραση πολυεράσης
Θερμοσταθερότητα
Πρωτεϊνική μηχανική
Σταθερότητα
Ημερομηνία έκδοσης 2024-03-29
Συλλογή   Σχολή/Τμήμα--Σχολή Θετικών και Τεχνολογικών Επιστημών--Τμήμα Βιολογίας--Μεταπτυχιακές εργασίες ειδίκευσης
  Τύπος Εργασίας--Μεταπτυχιακές εργασίες ειδίκευσης
Εμφανίσεις 14

Ψηφιακά τεκμήρια
No preview available

Δεν έχετε δικαιώματα για να δείτε το έγγραφο.
Δεν θα είναι διαθέσιμο έως: 2027-03-29