| Περίληψη |
Το μονοπάτι σηματοδότησης μέσω του υποδοχέα Notch είναι ένας συντηρημένος μηχανισμός στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς που συμμετέχει σε πολλές διαφορετικές διαδικασίες, σημαντικές για την ανάπτυξη ή τη δημιουργία ασθενειών. Ο διαμεμβρανικός υποδοχέας Notch πρέπει να αλληλεπιδράσει με τους διαμεμβρανικούς προσδέτες του, Delta ή Serrate/Jagged, σε trans διάταξη για να επιτευχθεί σηματοδότηση. Ακόμη, έχει δειχθεί πως απαραίτητη για τη λειτουργία των προσδετών, είναι η προηγούμενη ενεργοποίησή τους από δυο E3 λιγάσες ουβικουϊτίνης που προκαλούν την ενδοκυττάρωσή τους. Θελήσαμε να μελετήσουμε περαιτέρω τη σημασία της ενδοκυττάρωσης του προσδέτη Delta παρατηρώντας την οδό που ακολουθεί μέσα στο κύτταρο, σαν συνέπεια της ουβικουϊτινυλίωσης. Χρησιμοποιώντας μεταλλαγμένες μορφές της πρωτεΐνης Delta, οι οποίες επιλεκτικά δε μπορούν να αλληλεπιδράσουν με τις Ε3 λιγάσες, εξετάσαμε την υπόθεση στόχευσης του Delta σε συγκεκριμένο υποκυτταρικό διαμέρισμα σαν αποτέλεσμα της ουβικουϊτινυλίωσης του. Σαν δείκτες των ενδοσωματικών διαμερισμάτων χρησιμοποιήθηκαν οι καλά χαρακτηρισμένες RabGTPases. Με συνεστιακή μικροσκοπία και έπειτα ποσοτική ανάλυση, με τη χρήση ενός ημιαυτόνομου αλγορίθμου (OBCOL), υπολογίσαμε τα επίπεδα συνεντοπισμού του Delta και μεταλλαγμένων μορφών του με τα διαφορετικά υποκυτταρικά διαμερίσματα. Ενδιαφέροντα αποτελέσματα έδειξε η ανάλυση με τη Rab4-GTPάση που σχετίζεται με τα ενδοσώματα ανακύκλωσης. Μια επικρατώς αρνητική μορφή του Delta, που έχει χάσει τη δυνατότητα αλληλεπίδρασης με τις Ε3 λιγάσες, εντοπίζεται στατιστικώς σημαντικά λιγότερο στα Rab4 θετικά ενδοσώματα σε σχέση με την αγρίου τύπου πρωτεΐνη. Συμπερασματικά, υποθέτουμε πως η Rab4 εξαρτώμενη ανακυκλωτική οδός είναι αποτέλεσμα της ουβικουϊτινυλίωσης από τις E3 λιγάσες και πιθανόν να είναι σημαντική για τη Notch σηματοδότηση.
Για την επαλήθευση των παραπάνω αποτελεσμάτων, θελήσαμε να εφαρμόσουμε και μια λειτουργική δοκιμή του προσδέτη Delta, σε κύτταρα στα οποία διαταράσσουμε ελεγχόμενα συγκεκριμένες ενδοκυτταρικές οδούς. Χρησιμοποιώντας συνεχώς ενεργές ή επικρατώς αρνητικές μορφές των Rab GTPασών, ελέγξαμε τη δυνατότητα του Delta να ενεργοποιεί την έκφραση του γονιδίου στόχου του Notch, wingless, στο δίσκο του φτερού 3ου σταδίου προνυμφών. Στην παρούσα εργασία ξεκίνησε η βελτιστοποίηση των συνθηκών της παραπάνω ανάλυσης, αλλά δεν καταφέραμε να αποκτήσουμε κλώνους κυττάρων με διαταραγμένες ενδοκυτταρικές οδούς, πιθανόν λόγω κυτταρικής θνησιμότητας.
|
Ο υποκυτταρικός εντοπισμός του Delta, διαμεμβρανικού προσδέτη του υποδοχέα Notch, στη Drosophila melanogaster
