| Περίληψη |
Το Anabaena sp. PCC 7120 είναι ένα αρνητικό κατά Gram κυανοβακτήριο, το οποίο έχει την ικανότητα να πραγματοποιεί οξυγονική φωτοσύνθεση αλλά και καθήλωση αζώτου. Ένα από τα κυριότερα χαρακτηριστικά αυτού του βακτηρίου είναι ότι μπορεί να διαχωρίζει χωροταξικά τις δυο αυτές διαδικασίες, λόγω της ανάπτυξης δύο διαφορετικών ειδών κυττάρων (αγενή κύτταρα και ετεροκύστες). Η διαφοροποίηση των κυττάρων πραγματοποιήθηκε με την ανάπτυξη του βακτηρίου σε θρεπτικό μέσο BG11 για περίπου 10 ημέρες και στη συνέχεια σε BG110 για ακόμη 48 ώρες. Στην παρούσα εργασία εφαρμόστηκε πρωτόκολλο για την απομόνωση και διαλυτοποίηση των ετεροκυστών από τα τρία στελέχη, WT, ΔΗupL, ΔΗoxH και δοκιμάστηκαν δύο διαφορετικές μεθοδολογίες για την πρωτεομική τους ανάλυση.
Στην πρώτη προσέγγιση, οι πρωτεΐνες των ετεροκυστών διαχωρίστηκαν με δισδιάστατη ηλεκτροφόρηση σε συνδυασμό με ισοηλεκτρική εστίαση (IEF-SDS-PAGE 2D), πραγματοποιήθηκε πρωτεόλυση εντός της πηκτής και τα πεπτίδια που συλλέχτηκαν, ταυτοποιήθηκαν με MALDI-TOF/TOF-MS/MS. Tαυτοποιήθηκαν συνολικά 125 διαφορετικές πρωτεΐνες, μεταξύ των οποίων βρέθηκαν σημαντικές πρωτεΐνες που εμπλέκονται στη διαδικασία της φωτοσύνθεσης και στην απόκριση του κυττάρου σε συνθήκες stress. Επίσης, ταυτοποιήθηκαν και πρωτεΐνες που εμπλέκονται στη διαφοροποίηση των ετεροκυστών και στην καθήλωση του αζώτου, με μεγαλύτερο ποσοστό αυτών στον άγριο τύπο. Γενικότερα, ταυτοποιήθηκαν αρκετές μοναδικές πρωτεΐνες για κάθε στέλεχος, ενώ ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι για το στέλεχος ΔHoxH βρέθηκαν στο σύνολο, περισσότερες πρωτεΐνες.
Στη δεύτερη προσέγγιση, οι διαλυτοποιημένοι ετεροκύστες επεξεργάστηκαν με τη μέθοδο του FASP και τα πεπτίδια που συλλέχτηκαν ταυτοποιήθηκαν με nLC-ESI-MS/MS. Συνολικά, ταυτοποιήθηκαν 2728 διαφορετικές πρωτεΐνες και για τα τρία στελέχη, με μεγαλύτερο ποσοστό στον άγριο τύπο. Μεταξύ άλλων σημαντικές πρωτεΐνες που σχετίζονται με την καθήλωση του αζώτου και τη διαφοροποίηση των αγενών κυττάρων σε ετεροκύστες βρέθηκαν και στα τρία στελέχη. Η διαδικασία αυτή πέραν του μεγαλύτερου αριθμού ταυτοποιημένων πρωτεϊνών, έδωσε και τη δυνατότητα ταυτοποίησης πολύ περισσότερων μεμβρανικών πρωτεϊνών σε σύγκριση με την πρώτη προσέγγιση. Επιπλέον, προσέφερε ενδιαφέροντα αποτελέσματα σχετικά με τη λειτουργία της uptake και αμφίδρομης υδρογενάσης, τόσο στον άγριο τύπο όσο και στα μεταλλαγμένα στελέχη, καθώς και τη δυνατότητα διερεύνησης της επίδρασης των γενετικών τροποποιήσεων στη λειτουργία τόσο της νιτρογενάσης όσο και των υδρογενασών, στα στελέχη ΔHoxH και ΔΗupL.
Γενικότερα λοιπόν, και οι δύο μεθοδολογίες, αλλά κυρίως η δεύτερη, μας επέτρεψαν να εκτιμήσουμε ότι η απομόνωση και διαλυτοποίηση των ετεροκυστών επετεύχθη σε ικανοποιητικό βαθμό, προσφέροντας τη δυνατότητα καλύτερης κατανόησης του μεταβολισμού και της λειτουργίας τους.
|
Συγκριτική πρωτεομική ανάλυση ετεροκυστών από διαφορετικά στελέχη της Anabaena sp. PCC 7120
