| Περίληψη |
Η αλκαλική φωσφατάση από το στέλεχος ΤΑΒ5 (ΤΑΒ5 ΑΡ) παρουσιάζει χαρακτηριστικά ψυχρόφιλου ενζύμου, δηλαδή υψηλή καταλυτική ενεργότητα σε χαμηλές θερμοκρασίες και αξιοσημείωτη θερμοευαισθησία. Στην προσπάθεια μας να μελετήσουμε την εξελικτική διαδικασία και την μοριακή βάση της προσαρμογής των ενζύμων σε χαμηλές θερμοκρασίες, χρησιμοποιήσαμε τεχνικές κατευθυνόμενης εξέλιξης για την τροποποίηση της ΤΑΒ5 ΑΡ. Σε ένα πρώτο κύκλο δημιουργήθηκε βιβλιοθήκη μεταλλαγμένων κλώνων με τη χρήση του error prone PCR. Ο έλεγχος 13000 κλώνων οδήγησε στην επιλογή τριών θερμοσταθερών και τριών θερμοασταθών ενζύμων. Τρεις βιβλιοθήκες δημιουργήθηκαν μέσω in vitro ανασυνδυασμού των επιλεγμένων μεταλλαγών σε διαφορετικούς συνδυασμούς. Από την σάρωση τους επιλέχθηκαν τρεις θερμοασταθείς κλώνοι. Στην προσπάθεια να διερευνήσουμε πιθανό αθροιστικό αποτέλεσμα στην θερμοσταθερότητα λόγω της συνύπαρξης των μεταλλαγών S86A και G87A, σχεδιάσαμε το ένζυμο που φέρει την διπλή μεταλλαγή S86A/G87A μέσω κατάλληλων τεχνικών PCR. Τα επιλεγμένα ένζυμα χαρακτηρίστηκαν με τον προσδιορισμό των κινητικών και θερμοδυναμικών τους παραμέτρων. Ο αριθμός μετατροπής (kcat) των θερμοασταθών ενζύμων με τις μεταλλαγές H135E και H135E/G149D στους 30 oC ήταν υψηλότερος κατά 2 και 3 φορές αντίστοιχα, σε σχέση με του φυσικού ενζύμου. Τα ένζυμα με τις αμινοξικές αντικαταστάσεις S42G, S338T, S42G/S338T και S42G/H135E, αν και θερμοασταθή εμφανίζουν μικρότερη ενεργότητα. Αυτή η παρατήρηση μας επισημαίνει ότι μια σειρά δομικών απαιτήσεων πρέπει να πληρείται για την διατήρηση της βέλτιστης ενεργότητας. Τέλος, όλα τα θερμοσταθερά ένζυμα (S86A, G87A, S86A/G87A και G149D) εμφανίζονται λιγότερο ενεργά συγκρινόμενα με το φυσικό ένζυμο. Μέσω πειραμάτων διαφορικής θερμιδομετρίας γίνεται εμφανής η πλήρης έλλειψη αποδιατακτικών μεταβολών και οι μεγάλες αλλαγές στις τιμές των Tm των επιλεγμένων μεταλλαγών. Τα θερμοσταθερά ένζυμα χαρακτηρίζονται από αύξηση των Tm1 και Tm2 συγκρινόμενα με το φυσικό ένζυμο. Αντιθέτως τα θερμοασταθή ένζυμα φαίνονται να έχουν χάσει τελείως τις ενδιάμεσες αποδιατακτικές μορφές γύρω από τους 60°C. Εκτός του διπλά μεταλλαγμένου ενζύμου S86A/G87A, τα υπόλοιπα ένζυμα με υψηλότερα Tm1 και Tm2 δεν παρουσιάζουν αξιοσημείωτες μεταβολές της θερμιδομετρικής ενθαλπίας (ΔHcal). Ωστόσο, οι τιμές της ΔHcal έχουν δραστικά μειωθεί για τα μεταλλαγμένα ένζυμα με χαμηλότερα Tm. Η σύγκριση των μεταλλαγμένων ενζύμων με του αγρίου τύπου αποκάλυψε την λεπτή ισορροπία που υπάρχει ανάμεσα στην ενζυμική ενεργότητα και την δομική σταθερότητα. Σε συμφωνία με προηγούμενες εργασίες παρατηρήσαμε ότι η ενεργότητα σε χαμηλές θερμοκρασίες και η θερμοσταθερότητα μπορούν να βελτιωθούν ταυτόχρονα. Αυτή η παρατήρηση προέκυψε όταν συγκρίναμε το διπλά μεταλλαγμένο ένζυμο H135E/G149D με το ένζυμο που φέρει την μεταλλαγή H135E. Στην εργασία αυτή παρουσιάζεται η δομή της αγρίου τύπου ΤΑΒ5 ΑΡ καθώς και σύγκριση αυτής με άλλες δομές αλκαλικών φωσφατασών. Οι επιπτώσεις των επιλεγμένων μεταλλαγών στην θερμοσταθερότητα και την ενεργότητα μελετήθηκαν σε μοριακό επίπεδο κάνοντας χρήση αυτών των δομικών στοιχείων. Όλες οι επιλεγμένες μεταλλαγές εντοπίζονται γύρω από το ενεργό κέντρο, εξηγώντας με αυτόν τον τρόπο την επίδραση τους στην ενεργότητα του ενζύμου. Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι οι τρεις από τις έξι μεταλλαγές αφορούν αλλαγή καταλοίπου γλυκίνης (δύο αφαιρέσεις, μια προσθήκη), τονίζοντας την σημασία του συγκεκριμένου καταλοίπου στους μηχανισμούς προσαρμογής των ψυχρόφιλων ενζύμων.
|
Κατευθυνόμενη Εξέλιξη της Ψυχρόφιλης Αλκαλικής Φωσφατάσης TAB5
