| Περίληψη |
Στη παρούσα εργασία πραγματοποιήθηκε η μελέτη του φυτού Pancratium Maritimum, το οποίο ανήκει στην οικογένεια Amaryllidaceae, είναι ένα βολβώδες, αμμόφιλο, αυτοφυές φυτό που ζει και ολοκληρώνει τον βιολογικό του κύκλο στα παράλια της Μεσογείου και της Ιβηρικής χερσονήσου. Αρχικά πραγματοποιήθηκε η απομόνωση πρωτεϊνών από τους βολβούς του φυτού με χρήση της κατιονανταλλακτικής χρωματογραφίας με υλικό πλήρωσης S-Sepharose, με αυτό τον τρόπο διαχωρίστηκαν οι πρωτεΐνες από το μίγμα πρωτεϊνών. Δυο από αυτές τις πρωτεΐνες που απομονώθηκαν μας ενδιαφέρουν, των οποίων το μοριακό βάρος είναι περίπου στα 12kDa το οποίο υπολογίστηκε με βάση πρωτεΐνες γνωστού μοριακού βάρους μετά την ηλεκτροφόρηση τους σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE). Ακολούθησε καταβύθιση των πρωτεϊνών με διάφορους τρόπους, όπως με χρήση του τριχλωρικού οξέος (TCA) και οργανικού διαλύτη ακετόνη. Για την ταυτοποίηση έπειτα των πρωτεϊνών αυτών, εφαρμόστηκε φασματοσκοπία μάζας με μέθοδο ιοντισμού MALDI και αναλυτή μαζών χρόνου πτήσης TOF, όπου με τη βοήθεια της βιοπληροφορικής αναγνωρίστηκαν κάποιες αλληλουχίες πεπτιδίων, από ομόλογες πρωτεΐνες φυτικών οργανισμών, όπως Vitis vinifera, Oryza sativa, Zea mays. Οι περισσότερες ομόλογες πρωτεΐνες που προέκυψαν από τα φάσματα MS/MS των κύριων κορυφών είναι υποθετικές, παρόλα αυτά είναι γνωστές κάποιες λειτουργίες τους στο κύτταρο, όπως συμμετοχή σε μεταβολικές διαδικασίες, πρωτεΐνες δέσμευσης είτε άλλων μακρομορίων είτε ιόντων.
Επίσης το φυτό Pancratium Maritimum όπως και όλα τα φυτά της οικογένειας Amaryllidaceae θεωρείται φαρμακευτικό φυτό, λόγω πληθώρας ιδιοτήτων, οι οποίες οφείλονται στην περιεκτικότητα τους στις οργανικές ενώσεις αλκαλοειδή. Τα αλκαλοειδή σε μικρές ποσότητες εμφανίζουν αντικαρκινική, αντιική, αντιβιοτική, αναλγητική, αντιχολινεργική δράση καθώς και ιδιότητες φυτορμονών. Όμως σε μεγάλες ποσότητες θεωρούνται τοξικά για τον ανθρώπινο οργανισμό μέχρι και δηλητηριώδη. Έτσι πραγματοποιήθηκε απομόνωση των αλκαλοειδών ενώσεων από τους βολβούς του φυτού, σε μεθανολικό εκχύλισμα. Έπειτα σύμφωνα με το Molisch test διαπιστώθηκε ότι το μεθανολικό εκχύλισμα περιέχει γλυκοζίτες αλκαλοειδών και πιθανών και ελεύθερα σάκχαρα. Με τη χρήση της χρωματογραφίας λεπτής στιβάδας πραγματοποιήθηκε διαχωρισμός του μίγματος, και σε σύγκριση με τα βιβλιογραφικά δεδομένα αποκτήσαμε μια πρώτη εικόνα για τη σύσταση του μίγματος. Έπειτα ακολούθησε διαχωρισμός του μίγματος με τη χρήση της χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης ανάστροφης φάσης (PR-HPLC). Στα κύρια δυο κλάσματα που ελήφθησαν από την υγροχρωματογραφία, πραγματοποιήθηκε φασματοσκοπία MS, με πηγή ιοντισμού τον ηλεκτροψεκασμό (ESI) και αναλυτή μαζών την παγίδα ιόντων. Από τα φάσματα MS διαπιστώσαμε ότι το πρώτο κλάσμα περιέχεται ένας διγλυκοζίτης ενός υποκατεστημένου μορίου του αλκαλοειδούς Tazettine, της hydroxyl-O-methylotazettine και στο δεύτερο κλάσμα ένας διγλυκοζίτης του ενός υποκατεστημένου μορίου του αλκαλοειδούς Lycorine, της acetyllycorine. Επόμενος στόχος μας ήταν να ελέγξουμε την κυτταροτοξική και κατ’ επέκταση αντικαρκινική δράση του μεθανολικού διαλύματος που περιέχει μίγμα αλκαλοειδών, που έχουν απομονωθεί από τους βολβούς του φυτού Pancratium Maritimum, καθώς και τον δυο γλυκοζυλιωμένων αλκαλοειδών που ελήφθησαν μετά τον διαχωρισμό με τη χρήση της HPLC.
|
Απομόνωση και χαρακτηρισμός πρωτεΐνης από τον φυτικό οργανισμό Pancratium Maritimum
