| Περίληψη |
Ο Mac1 αποτελεί χαλκορυθμιζόμενο, μεταγραφικό παράγοντα του Saccharomyces cerevisiae. Προσδένεται σε ειδικές αλληλουχίες DNA και ρυθμίζει γονίδια (π.χ. CTR1, CTR3, FRE1, FRE7), οι πρωτεΐνες των οποίων είναι υπεύθυνες για την είσοδο του χαλκού στο κύτταρο. Η λειτουργικότητα του Mac1 επηρεάζεται αρνητικά από την
παρουσία ιόντων χαλκού και πιθανόν τροποποιείται μέσω πρωτεϊνικών
αλληλεπιδράσεων (Voutsina et al., 2001). Για ανεύρεση τέτοιων πρωτεϊνών πραγματοποιηθήκαν πειράματα σάρωσης γενωμικής βιβλιοθήκης με την τεχνολογία των
δύο υβριδίων στη ζύμη (Bilsland et al., 2004; Voutsina et al., 2005). Μεταξύ των αλληλεπιδρώντων βρέθηκε η πυρηνική φωσφοπρωτεΐνη Rad9 και η τσαπερόνη ιστονών Hir1.
Η Rad9 ανήκει στην κατηγορία των πρωτεϊνών ελέγχου του κυτταρικού κύκλου και είναι απαραίτητη στην μεταβίβαση σήματος για επιδιόρθωση, όταν το DNA υποστεί
βλάβη (σπάσιμο της δίκλωνης αλυσίδας) από ακτινοβόληση με ακτίνες Χ. Στην παρούσα
εργασία παρουσιάζονται στοιχεία που αποδεικνύουν ότι η Rad9, εκτός από τον ρόλο της
ως πρωτεΐνη ελέγχου του κυτταρικού κύκλου (checkpoint protein), έχει ένα νέο ρόλο
στην εξαρτώμενη από την RNA πολυμεράση II-μεταγραφή. Συγκεκριμένα, βρήκαμε ότι
η Rad9 αλληλεπιδρά άμεσα μέσω της BRCT επιικράτειάς της με τον χαλκορυθμιζόμενο
μεταγραφικό παράγοντα Mac1 επιδρώντας αρνητικά τόσο στην δυνατότητα πρόσδεσης
του στο DNA όσο και στην μεταγραφική του δυνατότητα. Επιπλέον βρήκαμε την Rad9
να στρατολογείται στα ρυθμιζόμενα από τον Mac1 γονίδια και μάλιστα η στρατολόγησή
της να εξαρτάται από τον Mac1. Η στρατολόγηση της δε, δεν περιορίζεται μόνο στον
υποκινητή των Mac1 ρυθμιζόμενων γονιδίων. Επεκτείνεται και κατά μήκος της κωδικής
περιοχής του γονιδίου CTR1, ακολουθώντας μάλιστα το ιδιαίτερο πρότυπο κατανομής
της RNA πολυμεράσης II. Αποδείξαμε ότι αποκλειστικά υπεύθυνα για την
στρατολόγηση της Rad9 στην κωδική περιοχή είναι στοιχεία του συμπλόκου έναρξης της
μεταγραφής αφού πετύχαμε την στρατολόγηση της Rad9 στην κωδική περιοχή του
γονιδίου ACT1 (όπου φυσιολογικά δεν στρατολογείται) συγχωνεύοντας στο 5΄ακρο του
στο γονιδίωμα τον υποκινητή του γονιδίου CTR1. Μάλιστα δείξαμε ότι η στρατολόγηση
3
της στην κωδική περιοχή εν μέρει οφείλεται στην πρωτεΐνη Hir1 (τσαπερόνη ιστονών) η
οποία εμπλέκεται τόσο στην έναρξη όσο και στην επιμήκυνση της μεταγραφής του CTR1
(βλέπε παρακάτω). Αντίθετα, η διμεθυλίωση της ιστόνης Η3 στην Κ79 γνωστή για την
αναγνώρισή της από την Rad9 σε περίπτωση βλάβης στο DNA (Huyen et al., 2004), δεν
φαίνεται να εμπλέκεται στην στρατολόγηση της Rad9 στην κωδική περιοχή του CTR1.
Ταυτόχρονα βρήκαμε την Rad9 να αλληλεπιδρά φυσικά και γενετικά και με παράγοντες
που εμπλέκονται στην έναρξη και επιμήκυνση της μεταγραφής του CTR1 (όπως η Hir1)
και παράλληλα να στρατολογεί στην κωδική περιοχή του CTR1 και άλλους παράγοντες
που εμπλέκονται στην επιδιόρθωση του DNA (για παράδειγμα την κινάση Rad53). Τα
δεδομένα μας, σε συνδυασμό με το γεγονός ότι το CTR1 (και η «γειτονία» του FRE1)
ανήκει σε μια ομάδα γονιδίων που χαρακτηρίζονται ως hotspot για μειωτικό
ανασυνδυασμό (ο οποίος ξεκινά με σπάσιμο της δίκλωνης αλυσίδας του DNA), μας
οδηγούν στο συμπέρασμα πως η Rad9 έχει διαμεσολαβητικό ρόλο μεταξύ στοιχείων του
συμπλόκου της μεταγραφικής μηχανής και του συμπλόκου επιδιόρθωσης του DNA κάτω
από φυσιολογικές, χωρίς προκλήσεις συνθήκες. Συνεπώς στοιχεία της μεταγραφικής
μηχανής (κυρίως χρωματινικοί αναδιαμορφωτές) είναι παρόντα στην περιοχή έναρξης
του μειωτικού ανασυνδυασμού και διαθέσιμα να χρησιμοποιηθούν από τον
επιδιορθωτικό μηχανισμό του DNA υπό την επίβλεψη του Rad9.
Παράλληλα διερευνήσαμε περαιτέρω τον ρόλο της Hir1, που όπως προαναφέρθηκε
αλληλεπιδρά με την Rad9 αλλά και με τον Mac1 (δείχνονται in vitro και in vivo -
Voutsina et al 2005). Ο Mac1 αποτελεί τον μοναδικό παράγοντα που προσδένεται στο
DNA και αλληλεπιδρά με την Hir1 (Voutsina et al 2005). Γενετικά και βιοχημικά
πειράματά μας, έδειξαν ότι η Hir1 παίζει ενεργοποιητικό ρόλο κατά την έναρξη της
μεταγραφής σε συνθήκες επαγωγής (έλλειψης χαλκού) επηρεάζοντας άμεσα την
στρατολόγηση του βασικού χρωματινικού αναδιαμορφωτή Snf2. Ταυτόχρονα βρήκαμε
ότι και η Hir1 στρατολογείται στην κωδική περιοχή του CTR1 ακολουθώντας το πρότυπο
κατανομής της RNA πολυμεράσης II. Επίσης η Hir1 δρα σε συνδυασμό με τον
παράγοντα Spt16 (υπομονάδα του yFACT) επάγοντας την επιμήκυνση της μεταγραφής
του CTR1. Ο αναδιαμορφωτής Snf2 ενώ εντοπίζεται στην κωδική περιοχή δεν ακολουθεί
το πρότυπο κατανομής της RNA πολυμεράσης ΙΙ. Επομένως αποκαλύψαμε ένα νέο ρόλο
για την Ηir1 κατά τον οποίο εμπλέκεται τόσο στην έναρξη όσο και στην επιμήκυνση της
4
μεταγραφής μιας νέας ομάδας γονιδίων που επάγονται από την έλλειψη χαλκού,
συνεργαζόμενη σε κάθε φάση του μεταγραφικού κύκλου με διαφορετικούς παράγοντες.
Υπό το φως των παραπάνω αποτελεσμάτων, ιδιαίτερη σημασία αποκτούν πειράματα
ταυτοποίησης πολυπρωτεϊνικών συμπλόκων με διαδοχική ανοσοκατακρήμνιση και
ανάλυση με φασματομετρία μάζας που πραγματοποιήσαμε πρόσφατα (σε συνεργασία με
την Dr.Rodriguez–Navarro / Institute of Principe Philippe, Valencia, Spain) με στόχο να
απομονώσουμε σύμπλοκα που φέρουν το σύνολο των παραγόντων που αλληλεπιδρούν με
τους μεταλλορυθμιζόμενους μεταγραφικούς παράγοντες σε διάφορες συνθήκες
καλλιέργειας. Αναμένουμε η προσέγγιση αυτή να συμβάλλει τόσο στην περαιτέρω
ανάλυση όσο και στην κατανόηση δράσης κομβικών πρωτεϊνών και μηχανισμών που
ρυθμίζουν πλήθος περιβαλλοντικά επαγόμενων σηματοδοτικών μονοπατιών.
|
Μελέτη της μεταλλορυθμιζόμενης μεταγραφής στον Saccharomyces cerevisiae: Απομόνωση νέων πολυπρωτεϊνικών συμπλόκων – Νέος ρόλος της πρωτεΐνης ελέγχου του κυτταρικού κύκλου Rad9 στη Mac1-ρυθμιζόμενη μεταγραφή
