| Περίληψη |
Η παρούσα διδακτορική διατριβή στοχεύει στην διαλεύκανση του ρόλου των
σηματοδοτικών μονοπατιών προ-φλεγμονωδών κυτταροκινών και πυρηνικών
υποδοχέων ορμονών στην ρύθμιση της έκφρασης των γονιδίων των
απολιποπρωτεϊνών του ανθρώπου σε ηπατικά κύτταρα. Οι απολιποπρωτεΐνες, μαζί με
ένζυμα του πλάσματος, τις πρωτεΐνες μεταφοράς λιπιδίων και τους υποδοχείς των
λιποπρωτεϊνών συμμετέχουν στην βιογένεση και τον καταβολισμό των
λιποπρωτεϊνών. Θεωρητικά, αλλαγές στη ρύθμιση της έκφρασης οποιασδήποτε
απολιποπρωτεΐνης ή άλλης πρωτεΐνης του συστήματος των λιποπρωτεϊνών, μπορεί να
επηρεάσει τη συγκέντρωση ή τη λειτουργία συγκεκριμένων ομάδων λιποπρωτεϊνών
και σε μερικές περιπτώσεις να συνεισφέρει στη παθογένεση υπερλιπιδαιμίας ή ακόμα
και στην ανάπτυξη αθηροσκλήρυνσης.
Στο πρώτο μέρος της εργασίας αυτής μελετήσαμε την επίδραση της προ-
φλεγμονώδους κυτταροκίνης TNFα (Τumour Νecrosis Factor α) στη ρύθμιση της
έκφρασης του γονιδίου της ανθρώπινης απολιποπρωτεΐνης CIII (apoCIII) σε ηπατικά
κύτταρα. Αυτό που εντοπίσαμε ήταν η ύπαρξη μίας ανταγωνιστικής δράσης μεταξύ
του TNFα και την άντι-φλεγμονώδους κυτταροκίνης TGFβ (Transforming Growth
Factor β) για τη ρύθμιση της έκφρασης του γονιδίου της apoCIII. Αποδείξαμε ότι ο
TNFα είναι ένας ισχυρός καταστολέας της μεταγραφικής ενεργότητας διαφόρων
υποκινητών των απολιποπρωτεϊνών, οι οποίοι φέρουν θέσεις πρόσδεσης για τον
HNF-4α (hepatocyte nuclear factor 4α) και ότι για τη καταστολή αυτή απαιτείται η
παρουσία του HNF-4α, ο οποίος είναι και ένας από τους βασικότερους ρυθμιστές της
έκφρασης ηπατο-ειδικών γονιδίων στα θηλαστικά. Με τη χρήση συγκεκριμένων
αναστολέων των μονοπατιών που επάγονται από τον TNFα, αποδείξαμε ότι η
καταστολή του υποκινητή του γονιδίου της apoCIII από τον TNFα, προκαλείται μέσω
της ενεργοποίησης του μεταγραφικού παράγοντα NF-κB (nuclear factor κB). Με τη
χρήση της πρωτεΐνης LMP1 (Latent Μembrane Protein 1) του ιού Epstein–Barr, που
έχει την ικανότητα να ενεργοποιεί τον NF-κB καθώς και τη χρήση επαγωγέων του
NF-κB μονοπατιού, αποδείξαμε ότι ο NF-κB είναι, εν μέρει, υπεύθυνος για την
ισχυρή καταστολή τόσο της μεταγραφικής ενεργοποίησης του υποκινητή του
γονιδίου της apoCIII, όσο και της μεταγραφικής ικανότητας του HNF-4α. Ο TNFα
δεν φαίνεται να έχει κάποια επίδραση στον ενδοκυτταρικό εντοπισμό ή τα πρωτεϊνικά
επίπεδα του HNF-4α, φαίνεται όμως να επιδρά κατασταλτικά, ως ένα βαθμό, στην
ικανότητά του HNF-4α για πρόσδεση στο στοιχείο HRE (hormone response element)
του κοντινού υποκινητή του γονιδίου της apoCIII. Με τη χρήση του συστήματος
μεταγραφικής ενεργοποίησης GAL4 του σακχαρομύκητα, αποδείξαμε ότι ο TNFα
καταστέλλει τη μεταγραφική λειτουργία τόσο της AF-1 όσο και της AF-2 (activation
functions 1 and 2) περιοχής του HNF-4α και ότι η καταστολή αυτή μπορεί να
ξεπεραστεί με την υπερέκφραση διαφόρων συν-ενεργοποιητών του HNF-4α μεταξύ
των οποίων ο PGC-1α (peroxisome-proliferator-activated-receptor-γ co-activator 1α),
ο CBP [CREB (cAMP-response-element-binding protein) binding protein] και ο
SRC3 (steroid receptor co-activator 3). Τέλος, με τη χρήση in vitro τεχνικών
αποδείξαμε την ύπαρξη άμεσης φυσικής αλληλεπίδρασης μεταξύ του HNF-4α και της
υπομονάδας p65/Rel A του NF-κB.
Στο δεύτερο μέρος της εργασίας αυτής μελετήσαμε την επίδραση του TNFα
στην ρύθμιση της έκφρασης γονίδιων απολιποπρωτεϊνών, πυρηνικών υποδοχέων
ορμονών και συν-ρυθμιστών, σε ηπατικά κύτταρα ανθρώπου. Με τη χρήση της
μεθόδου RT-PCR (Reverse Transcription-PCR) είδαμε ότι τα πρότυπα έκφρασης
πολλών γονιδίων παρουσιάζουν μία πρώιμη και μία όψιμη απόκριση στην παρουσία
του TNFα. Αυτό θα μπορούσε να είναι το αποτέλεσμα διαφορετικών μετα-
μεταφραστικών τροποποιήσεων, που προκαλούνται από τα διάφορα σηματοδοτικά
μονοπάτια του TNFα σε ρυθμιστικές πρωτεΐνες οι οποίες ελέγχουν θετικά ή αρνητικά
την έκφραση των γονιδίων αυτών. Εξετάζοντας τα πρότυπα έκφρασης δύο πολύ
σημαντικών συν-ρυθμιστών των πυρηνικών υποδοχέων, του αναστολέα των
πυρηνικών υποδοχέων SHP (Small Heterodimer Partner) και του συν-ενεργοποιητή
PGC-1α, και χρησιμοποιώντας έναν ειδικό αναστολέα της MEK1/2 κινάσης,
αποδείξαμε ότι ο TNFα ρυθμίζει την έκφραση των δύο αυτών γονίδιων μέσω του
σηματοδοτικού μονοπατιού της MEK1/2 κινάσης.
Στο τρίτο μέρος εξετάσαμε με μεγαλύτερη λεπτομέρεια την επίδραση του
TNFα στην ρύθμιση της έκφρασης του γονιδίου του SHP. Αυτό που είδαμε είναι ότι ο
TNFα ρυθμίζει την έκφραση του γονιδίου του SHP όχι μόνο μέσω του μονοπατιού
της MEK1/2 κινάσης, αλλά και μέσω της ενεργοποίησης του NF-κB. Και τα δύο αυτά
μονοπάτια φαίνεται να παίζουν κατασταλτικό ρόλο στην μεταγραφική ενεργότητα
του υποκινητή του γονιδίου του SHP. Επιπλέον, προσδιορίσαμε την περιοχή του
υποκινητή του γονιδίου του SHP μέσω της οποίας δρα ο NF-κB και η οποία
εντοπίζεται μεταξύ των νουκλεοτιδίων -1383/-865. Τέλος, δείξαμε ότι ο HNF-4α και
ο συν-ενεργοποιητής PGC-1α, αποτελούν ισχυρούς ενεργοποιητές της έκφρασης του
γονιδίου του SHP στα ηπατικά κύτταρα.
Στο τέταρτο μέρος της εργασίας αυτής επικεντρωθήκαμε στον ρόλο της
πρωτεΐνης Tpl2/Cot, που ανήκει στην οικογένεια των MAP3K και ενεργοποιείται από
την παρουσία προ-φλεγμονωδών κυτταροκινών, όπως ο TNFα, στην ρύθμιση της
έκφρασης των γονιδίων των απολιποπρωτεϊνών και στην μεταγραφική ικανότητα των
πυρηνικών υποδοχέων, σε ηπατικές κυτταρικές σειρές. Δείξαμε ότι η Tpl2
καταστέλλει ισχυρά τη συστατική ενεργότητα του HNF-4α καθώς και την επαγόμενη
από HNF-4α μεταγραφική ενεργοποίηση του υποκινητή του γονιδίου της apoCIII στη
κυτταρική σειρά ηπατώματος HepG2 του ανθρώπου. Με τη χρήση ειδικών
αναστολέων και μεταλλαγμάτων με αρνητικώς επικρατούσα δράση, αποδείξαμε ότι
για την καταστολή της ενεργότητας του HNF-4α από την Tpl2 δεν απαιτούνται τα
μονοπάτια του NF-κB ή της MEK1/2 κινάσης. Αποδείξαμε ότι η καταστολή της
μεταγραφικής ικανότητας του HNF-4α από την Tpl2 δεν είναι αποτέλεσμα μειωμένης
ικανότητας του HNF-4α για πρόσδεση στο DNA, αλλά μειωμένης ικανότητας για
αλληλεπίδραση με τον συν-ενεργοποιητή του, τον PGC-1α. Η υπερέκφραση μίας
αρνητικώς επικρατούσας μορφής της Tpl2/Cot καθώς και η παρουσία ενός shorthairpin
mRNA της Cot είχαν ως αποτέλεσμα την ισχυρή ενεργοποίηση όλων των
γονιδίων των απολιποπρωτεϊνών που αναλύθηκαν στη κυτταρική σειρά HepG2,
επιβεβαιώνοντας με τον τρόπο αυτό τη σπουδαιότητα της ενδογενούς Cot στη
ρύθμιση διαφόρων γονιδίων των απολιποπρωτεϊνών στα ηπατικά κύτταρα. Τέλος,
δείξαμε ότι η Tpl2/Cot είχε την ικανότητα να καταστείλει, την επαγόμενη από
συνδέτη, ενεργοποίηση των πυρηνικών υποδοχέων RXRα και T3Rβ,
χρησιμοποιώντας το GAL4-σύστημα, αλλά και μέσω της RXRα/T3Rβ-εξαρτώμενης
μεταγραφικής ενεργοποίησης του υποκινητή της apoCII. Αυτό μας οδηγεί στο
συμπέρασμα ότι η Tpl2/Cot πρέπει να παίζει έναν ευρύτερο ρόλο στην ρύθμιση της
μεταγραφικής ικανότητας των πυρηνικών υποδοχέων ορμονών στα ηπατικά κύτταρα.
Στο πέμπτο μέρος της εργασίας αυτής μελετήσαμε το ρόλο της
φωσφορυλίωσης στην ενεργότητα των πυρηνικών υποδοχέων ορμονών.
Παρατηρήσαμε ότι η επώαση της κυτταρικής σειράς HepG2 με το χημειοθεραπευτικό
φάρμακο 5-Φθοροουρακίλη (5-Fluorouracil, 5-FU) είχε ως αποτέλεσμα την
φωσφορυλίωση του HNF-4α σε μοτίβα Ser/Thr-Pro. Η μετα-μεταφραστική αυτή
τροποποίηση του HNF-4α φαίνεται ότι καταστέλλει την μεταγραφική ικανότητα του
HNF-4α καθώς και την μεταγραφική ενεργότητα του υποκινητή του γονιδίου της
apoCIIΙ. Διερευνήθηκε επίσης ο πιθανός ρόλος της πρόλυλο cis/trans ισομεράσης
Pin1 στη ρύθμιση της μεταγραφικής ικανότητας των πυρηνικών υποδοχέων HNF-4α
και RXRα. Και στις δύο περιπτώσεις η παρουσία της Pin1 άσκησε κατασταλτική
δράση στην μεταγραφική ικανότητα των φωσφορυλιωμένων σε μοτίβα Ser/Thr-Pro
πυρηνικών υποδοχέων. Τέλος, μελετήσαμε την πιθανή ανάμειξη της Pin1 στη
ρύθμιση της έκφρασης διαφόρων υποκινητών γονιδίων των απολιποπρωτεϊνών.
Φαίνεται ότι η Pin1 ρυθμίζει με θετικό τρόπο την έκφραση του γονιδίου της apoE,
ένα δεδομένο που απαιτεί περαιτέρω εξέταση.
|
Μονοπάτια σηματοδότησης που ρυθμίζουν την έκφραση των γονιδίων των απολιποπρωτεϊνών του ανθρώπου
