| Περίληψη |
Τα γονίδια hrp(hypersensitive reaction and pathogenicity) των φυτοπαθογόνων βακτηρίων, τα οποία προσδιορίστηκαν αρχικά στο βακτήριο Pseudomonas syringae pv. phaseolicola, είναι υπεύθυνα τόσο για την ικανότητα τους να προκαλούν ασθένεια σε ευπαθή φυτά, όσο και για την ικανότητα να πυροδοτούν την αντίδραση υπερευαισθησίας (Ηypersensitive reaction, HR) σε ανθεκτικά φυτά. Η αντίδραση HR θεωρείται ένας από τους σημαντικότερους μηχανισμούς άμυνας των φυτών και η φαινοτυπική της εκδήλωση εξαρτάται τόσο από γονίδια του παθογόνου, hrp και avr (avirulence genes), όσο και από γονίδια του φυτού (R, resistance genes). Ορισμένα γονίδια hrp κωδικοποιούν συστατικά ενός εξειδικευμένου συστήματος έκκρισης πρωτεϊνών, που ονομάζεται εκκριτικό σύστημα "τύπου ΙΙΙ" και είναι παρόμοιο μ' εκείνο που χρησιμοποιούν ζωικά παθογόνα βακτήρια, όπως Salmonella, Yersinia, Shigella, για να εκκρίνουν πρωτεϊνες παθογένειας. Στα φυτοπαθογόνα βακτήρια το εκκριτικό αυτό μονοπάτι ελέγχει την έκκριση μιας ομάδας πρωτεϊνών, μεταξύ των οποίων είναι οι χαρπίνες και οι πρωτεϊνες Avr. Oι χαρπίνες (HrpZ, HrpN και PopA1) είναι οι μόνες γνωστές βακτηριακές πρωτεϊνες, που επάγουν την αντίδραση υπερευαισθησίας, μετά από έγχυσή τους σε καθαρή μορφή στους μεσοκυττάριους χώρους φύλλων. Προκειμένου να μελετηθεί ο ρόλος της πρωτεϊνης HrpZPsp, του βακτηρίου Pseudomonas syringae pv. phaseolicola, στην αντίδραση υπερευαισθησίας, εκφράστηκε το γονίδιο hrpΖPsp σε φυτά καπνού. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκαν δύο συστήματα φορέων έκφρασης: το ρυθμιζόμενο σύστημα έκφρασης, επαγόμενο από την τετρακυκλίνη, για τις ανάγκες του οποίου κατασκευάστηκαν σταθερά μετασχηματισμένα φυτά και το παροδικό ιικό σύστημα έκφρασης, που βασίζεται στον ιό PVX202. Και στις δύο περιπτώσεις χρησιμοποιήθηκαν κατασκευές, σχεδιασμένες έτσι ώστε η πρωτεϊνη να εκφράζεται είτε στην κανονική της μορφή είτε συντηγμένη με το εκκριτικό πεπτίδιο της πρωτεϊνης PR1a του καπνού, ώστε η παραγόμενη πρωτεϊνη να εκκρίνεται στους μεσοκυττάριους χώρους του φύλλου. Η παραγωγή της HrpΖ στα διαγονιδιακά φυτά δεν οδήγησε σε νέκρωση, ανεξάρτητα της παρουσίας ή απουσίας του εκκριτικού πεπτιδίου, αποτέλεσμα που αποδόθηκε στο χαμηλό επίπεδο παραγωγής της. Αντίθετα, με τον ιικό φορέα έκφρασης PVX202 δείχτηκε ότι η παραγωγή της εκκρινόμενης μορφής της χαρπίνης επάγει τη εμφάνιση νεκρωτικών κηλίδων, χαρακτηριστικών της HR, σε φύλλα καπνού. Τα αποτελέσματα αυτά καταδεικνύουν ότι η θέση δράσης της χαρπίνης στα φυτικά κύτταρα είναι εξωκυττάρια. Στην παρούσα μελέτη παρατηρήθηκε ότι η χαρπίνη, σε φυτικά όπως και σε βακτηριακά κύτταρα, εμφανίζεται με δύο διαφορετικές ηλεκτροφορητικές μορφές. Διερεύνυση της προέλευσης των δύο αυτών μορφών κατέληξε στο συμπέρασμα, ότι η μορφή της χαρπίνης με τη μεγαλύτερη ηλεκτροφορητική κινητικότητα είναι προϊόν εναλλακτικής έναρξης της μετάφρασης, από ένα εσωτερικό κωδικόνιο AUG16, στο ευκαρυωτικό σύστημα μετάφρασης. H αντίστοιχη μορφή, που παράγεται στην E.coli, είναι αμινοτελικά ακρωτηριασμένη, στο αμινοτελικό κατάλοιπο Α17. Το εκκριτικό μονοπάτι Hrp είναι επίσης υπεύθυνο για τη μεταφορά πρωτεϊνών Avr, που καθορίζουν τη φυλετική εξειδίκευση του παθογόνου, τις οποίες θεωρείται ότι εισάγει κατ' ευθείαν στα κύτταρα-ξενιστές. Βασιζόμενοι σε ενδείξεις, ότι οι χαρπίνες και οι πρωτεϊνες Avr πρέπει να εκφράζονται από το ίδιο βακτηριακό κύτταρο, προκειμένου να πυροδοτηθεί η αντίδραση υπερευαισθησίας, ελέγχθηκε αν οι πρωτεϊνες αυτές αλληλεπιδρούν μεταξύ τους. Παράλληλα εξετάστηκε ποιές πρωτεϊνες Hrp αλληλεπιδρούν μεταξύ τους, προκειμένου να αναπτυχθεί ένα μοντέλο λειτουργικής αρχιτεκτονικής της εκκριτικής συσκευής Hrp. Δύο πειραματικές προσεγγίσεις ακολουθήθηκαν: το σύστημα των δύο υβριδίων της ζύμης και η μέθοδος "Far western". Στην περίπτωση των πρωτεϊνών, AvrPphB και AvrPto, δεν διαπιστώθηκε αλληλεπίδραση με τη χαρπίνη, γεγονός που υποδηλώνει ότι η εξάρτηση της μεταφοράς τους μέσα στα φυτικά κύτταρα δεν απαιτεί φυσική επαφή με τη χαρπίνη. Ενδεχόμενα, η χαρπίνη να υπεισέρχεται σε άλλο στάδιο της εκκριτικής ή μετα-εκκριτικής διαδικασίας. Σε ότι αφορά τις πρωτεϊνες Hrp, διαπιστώθηκε μοριακή αλληλεπίδραση μεταξύ των πρωτεϊνών HrcQa και HrcQb. Επιπλέον, δείχτηκε ότι η HrcQb αλληλεπιδρά με το καρβοξυτελικό τμήμα της HrcQa, προσδιορίζοντας έτσι και την μεμβρανική τοπολογία της HrcQa.
|
Συλλογές
