| Περίληψη |
Η ικανότητα ορισμένων μορίων RNA να δρούν καταλυτικά στις χημικές αντιδράσεις διάσπασης, είτε του εαυτού τους είτε άλλων αλυσίδων RNA, τους έχει προσδώσει την ονομασία: "RNA ένζυμα" ή "ριβοένζυμα". Συναντώνται σε διάφορα βιολογικά συστήματα και μια από τις κατηγορίες, στις οποίες κατατάσσονται, είναι και εκείνη των "σφυροκέφαλων" ριβοενζύμων (hammerhead ribozymes). Περιλαμβάνει μόρια RNA που κατέχουν: α) μια συγκεκριμένη ριβονουκλεοτιδική περιοχή, που σχηματίζει την έλικα ΙΙ και στην οποία οφείλονται οι καταλυτικές ιδιότητες διάσπασης του υποστρώματος-RNA σε ορισμένη θέση και β) εκατέρωθεν αυτής εκτείνονται ριβονουκλεοτιδικές αλληλουχίες που είναι συμπληρωματικές με αντίστοιχες του υπό διάσπαση υποστρώματος-RNA και σχηματίζουν τις έλικες Ι και ΙΙΙ. Σ' αυτήν την κατηγορία ανήκουν τα καταλυτικά αντικωδικά RNA, δηλαδή εκείνα που διασπούν το υπόστρωμά τους σε συγκεκριμένη θέση, αλλά οι εκατέρωθεν της καταλυτικής περιοχής ριβονουκλεοτιδικοί βραχίονες πρόσδεσης στο υπόστρωμα, έχουν μεγάλο μήκος. Ένας από τους σκοπούς αυτής της διατριβής, ήταν να μελετηθεί η επίδραση των διαφόρων ελλείψεων ή αλλαγών στις νουκλεοτιδικές περιοχές του ριβοενζύμου, που με τις αντίστοιχες του υποστρώματος-RNA σχηματίζουν τις έλικες Ι και ΙΙΙ, στην συνολική ικανότητα διάσπασης (ενζυμική ενεργότητα) των καταλυτικών αντικωδικών RNA. Για τον λόγο αυτό κατασκευάστηκαν διάφορα καταλυτικά RNA, που είχαν ως στόχο τους διαφορετικές περιοχές του γενωμικού ή αντιγενωμικού RNA του ιού Sendai, ο οποίος προσβάλλει κύτταρα θηλαστικών οργανισμών. Ολα περιείχαν την ίδια καταλυτική περιοχή, βασισμένη σ' αυτή του τύπου των "σφυροκέφαλων" ριβοενζύμων, αλλά μερικά είχαν αφαιρέσεις ή μεταλλάξεις νουκλεοτιδίων, με αποτέλεσμα τον μη κανονικό σχηματισμό των ελίκων Ι και ΙΙΙ. Για τον καθορισμό των ρυθμών της διαδικασίας διάσπασης για τα διαφορετικά ριβοένζυμα χρησιμοποιήθηκαν προσχηματισμένα σύμπλοκα μεταξύ υποστρώματος-RNA και ριβοενζύμου. Βρέθηκε ότι η νουκλεοτιδική αλληλουχία, που περιβάλλει τη θέση-στόχο είχε επίδραση στήν αποτελεσματικότητα της αντίδρασης διάσπασης. Αφαιρέσεις ή μεταλλάξεις των νουκλεοτιδίων 2.1 ή 15.1 και 15.2, σύμφωνα με το σύστημα αρίθμησης των "σφυροκέφαλων" ριβοενζύμων των Hertel κ.α. (1992), κατάστρεφαν την καταλυτική δράση. Αφαιρέσεις του νουκλεοτιδίου 2.2 ή πρόσθετων νουκλεοτιδίων στο ριβοένζυμο στην περιοχή σχηματισμού της έλικας Ι δεν κατέστρεφε, αλλά μόνο ελάττωνε την αποτελεσματικότητα της αντίδρασης. Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν με αφαίρεση του νουκλεοτιδίου 15.3 στην περιοχή της έλικας ΙΙΙ. Ταυτόχρονες αφαιρέσεις νουκλεοτιδίων από το ριβοένζυμο στις περιοχές σχηματισμού των ελίκων Ι και ΙΙΙ, είχαν σαν αποτέλεσμα την διάσπαση του υποστρώματος-RΝΑ σε διαφορετική θέση. Έτσι φαίνεται οτι, η περιοχή της έλικας Ι είναι "ελαστικότερη" στις τροποποιήσεις των νουκλεοτιδίων της, ενώ η φύση των νουκλεοτιδίων, που περιβάλλουν τη θέση-στόχο, παίζουν σημαντικό ρόλο στην ταχύτητα της αντίδρασης διάσπασης και στην απόλυτη εξειδίκευση του ριβοενζύμου για ένα συγκεκριμένο υπόστρωμα-RNA. Δεύτερος σκοπός αυτής της διατριβής ήταν η πραγματοποίηση μιας συστηματικότερης μελέτης για το, πως η οποιαδήποτε αλληλουχία των ριβονουκλεοτιδίων, όπως αυτή προκύπτει από τον τύπο NUX, όπου N= A, C, G, U και X= A, C, U, στη θέση-στόχο του υποστρώματος-RNA, επηρεάζει την αποτελεσματικότητα της αντίδρασης διάσπασης, όταν οι αλληλουχίες ριβονουκλεοτιδίων στις έλικες Ι και ΙΙΙ παραμένουν όμοιες. Για τον λόγο αυτό η τριπλέτα AUC στη θέση 374-376 του RNA του ιού HIV-1 (human immunodeficiency virus type-1) χρησιμοποιήθηκε ως μεταλλάξιμη μήτρα, ώστε να δημιουργηθούν όλοι οι 12 δυνατοί συνδυασμοί, που προκύπτουν από τον τύπο NUX. Έτσι, κατασκευάστηκαν τέσσερα ασύμμετρα "σφυροκέφαλα" ριβοένζυμα, που διέφεραν στο νουκλεοτίδιο συμπληρωματικό του Ν, από τα οποία το κάθε ένα ήταν ειδικό για τρείς από τις 12 διαφορετικές θέσεις-στόχους του υποστρώματος-RNA. Η υπόλοιπη νουκλεοτιδική αλληλουχία στις περιοχές σχηματισμού των ελίκων Ι και ΙΙΙ, τόσο του υποστρώματος όσον και του ριβοενζύμου, παρέμεινε αναλλοίωτη. Όλοι οι 12 συνδυασμοί μπορούσαν να διασπαστούν από τα αντίστοιχα ριβοένζυμα, αλλά οι σταθερές της αντίδρασης διάσπασης, όπως αυτές μετρήθηκαν στους 370C, παρουσίασαν σημαντική ποικιλότητα που εξαρτώνταν από τον τύπο της τριπλέτας νουκλεοτιδίων, που υπήρχαν στη θέση-στόχο. Την καλύτερη απόδοση είχαν οι NUC τριπλέτες, με καλύτερη και των 12, την AUC. Σύγκριση με προηγούμενες μελέτες δείχνει ότι, η νουκλεοτιδική αλληλουχία που περιβάλλει τη θέση-στόχο, παίζει σημαντικότατο ρόλο στην παρατηρούμενη ικανότητα διάσπασης του υποστρώματος από το αντίστοιχο ριβοένζυμο. Τέλος, σε μια προσπάθεια να μελετηθεί η in vivo δράση των αντικωδικών RNA και των "σφυροκέφαλων" καταλυτικών αντικωδικών RNA, επιλέχθηκε το βιολογικό σύστημα του σακχαρομύκητα, Saccharomyces cerevisiae. Για τον σκοπό αυτό σχεδιάστηκε και χρησιμοποιήθηκε μια ευαίσθητη πειραματική διαδικασία, όπου το αποτέλεσμα θα ήταν άμεσα ορατό και μετρήσιμο. Ο στόχος ήταν μέρος του gcn4 mRNA συνδεμένου πριν από το lacZ mRNA (gcn4/lacZ) ή ολόκληρο το gcn4 mRNA. Το προϊόν του γονιδίου gcn4 αποτελεί έναν καλά μελετημένο μεταγραφικό ενεργοποιητή της βιοσύνθεσης των αμινοξέων. Το ίδιο το γονίδιο ενεργοποιείται κάτω από συνθήκες πείνας. Αυτό επιτυγχάνεται με την παρουσία 3-αμινο-τριαζόλης (ΑΤ) στο θρεπτικό μέσο της καλλιέργειας των κυττάρων, οπότε αναστέλλεται η δράση του προϊόντος του γονιδίου his3 και δημιουργείται έλλειψη της ιστιδίνης. Το αντικωδικό RNA και το ριβοένζυμο μεταγράφονταν από ένα πλασμίδιο-φορέα κλωνοποίησης και έκφρασης ειδικό για τον σακχαρομύκητα, ενώ και τα δύο είδη υποστρώματος-RNA εκφράζονταν είτε από ένα άλλο ζυμοειδικό πλασμίδιο είτε από το χρωμόσωμα του σακχαρομύκητα. Η αποτελεσματικότητα της δράσης του αντικωδικού RNA και του ριβοενζύμου πάνω στο στόχο τους υπολογίστηκε με μέτρηση της ενζυμικής δράσης της β-γαλακτοσιδάσης ή με έλεγχο ευαισθησίας σε 3-αμινο-τριαζόλη (AT). Μόνο σε μια από τις περιπτώσεις, όπου το gcn4/lacZ mRNA εκφράζονταν από πλασμίδιο, παρατηρήθηκε σε κύτταρα, που έκφραζαν το ριβοένζυμο, μείωση της ενεργότητας της β-γαλακτοσιδάσης κατά 50% περίπου, που δεν συνοδεύονταν όμως με αντίστοιχη μείωση του mRNA. Ένα τέτοιο αποτέλεσμα δεν μπορεί να βοηθήσει στην εξαγωγή συγκεκριμένων συμπερασμάτων για την δράση και την εφαρμογή της τεχνολογίας των "σφυροκέφαλων" ριβοενζύμων, στον έλεγχο ή καταστολή της γονιδιακής έκφρασης στο σακχαρομύκητα.
|
Συλλογές
