| Περίληψη |
Η παρούσα διδακτορική διατριβή πραγματοποιήθηκε με στόχο την μελέτη 1) της κυτοχρωμικής c οξειδάσης (CcO), η οποία είναι το ένζυμο που καταλύει την αναγωγή του μοριακού οξυγόνου στην αερόβια αναπνοή θηλαστικών και βακτηρίων, και 2) της αναγωγάσης του μονοξειδίου του αζώτου (NOR) που καταλύει την αναγωγή του μονοξειδίου του αζώτου στην αναερόβια αναπνοή των βακτηρίων. Η ενεργή θέση της CcO είναι ένα διπυρηνικό κέντρο αποτελούμενο από μία αίμη υψηλής διαμόρφωσης σπιν και ένα άτομο χαλκού, τον CuB. Στην NOR, η ενεργή θέση του ενζύμου αποτελείται από μία αίμη υψηλής διαμόρφωσης σπιν και ένα άτομο μη-αιμικού FeB. Ένας από τους στόχους στην μελέτη της CcO ήταν ο χαρακτηρισμός του δομικού και λειτουργικού ρόλου της Tyr280, η οποία διατηρεί ομοιοπολικό δεσμό με έναν από τους υποκαταστάστες του CuB, την Ηis276. Αρχικά, χαρακτηρίσαμε με φασματοσκοπία συντονισμού Raman και FTIR το κυτόχρωμα αα3 του βακτηρίου Paracoccus denitrificans στο οποίο έχει πραγματοποιηθεί η μετάλλαξη της Tyr280 σε ιστιδίνη στην οξειδωμένη και ανηγμένη μορφή καθώς επίσης και το CO-σύμπλοκο του ενζύμου. Η αίμη α3 διατηρεί την ίδια διαμόρφωση σπιν, αριθμό συναρμογής, εγγύ και μακρινό περιβάλλον στην οξειδωμένη και ανηγμένη μορφή τόσο του φυσικού όσο και του Υ280Η μεταλλαγμένου ενζύμου. Η ενεργή θέση διατηρεί την ικανότητα δέσμευσης και αναγωγής του οξυγόνου στο μεταλλαγμένο ένζυμο, και άρα η σταθερότητα του διπυρηνικού κέντρου δεν επηρεάζεται από την απουσία του ομοιοπολικού δεσμού Τyr280-His276. Μελετήθηκαν τα 607 και 580 nm ενδιάμεσα της χημείας οξυγόνου της CcO σε θερμοκρασία δωματίου με φασματοσκοπία UV/Vis και συντονισμού Raman, μέσω της αντίδρασης του οξειδωμένου κυτοχρώματος αα3 από το βακτήριο P. denitrificans με το H2O2. ιερευνήθηκε, επίσης ο ρόλος της τυροσίνης 280 στον σχηματισμό των 607 και 580 nm μορφών μέσω της σύγκρισης των αντιδράσεων της οξειδωμένης μορφής του φυσικού και μεταλλαγμένου Υ280Η κυτοχρώματος αα3 με το H2O2, αλλά και της μικτού σθένους μορφής των ενζύμων με το Ο2. ιαπιστώθηκε ότι οι ίδιες μορφές σχηματίζονται κατά τις αντίστοιχες αντιδράσεις φυσικού και μεταλλαγμένου ενζύμου, και κατά συνέπεια προτείνουμε ότι η Υ280 δεν μετέχει στον σχηματισμό αυτών των ενδιαμέσων Η δομή και η δυναμική του διπυρηνικού κέντρου του κυτοχρώματος cαα3 από το βακτήριο T. thermophilus, που παρουσιάζει και ενεργότητα αναγωγάσης του ΝΟ, μελετήθηκε με φασματοσκοπία FTIR και time-resolved step scan FTIR. Το κυτόχρωμα caa3 είναι το μόνο μέλος της οικογένειας των αα3-τύπου οξειδασών που το διπυρηνικό του κέντρο αποτελείται από μία αίμη β-διαμόρφωσης και CuB α-διαμόρφωσης. Τα παραπάνω αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι οι ιδιότητες του διπυρηνικού κέντρου που έχουν ως αποτέλεσμα την σταθεροποίηση της α-διαμόρφωσης δεν είναι απαραίτητες για την ενζυματική δραστικότητα. Προτάθηκε επίσης μοντέλο για την περιγραφή της δυναμικής δέσμευσης/αποδέσμευσης υποκαταστατών στο ενεργό κέντρο. Με την ίδια μεθοδολογία πραγματοποιήθηκε επίσης συγκριτική μελέτη των κυτοχρωμάτων αα3 και ba3 του βακτηρίου P. denitrificans. Χαρακτηρίστηκε η δομή του διπυρηνικού κέντρου αιμικού/μη-αιμικού σιδήρου της αναγωγάσης του μονοξειδίου του αζώτου από το βακτήριο P. denitrificans, κατά την μετάβαση από την οξειδωμένη στην ανηγμένη κατάσταση του ενζύμου με φασματοσκοπία συντονισμού Raman, καθώς επίσης και του CO συμπλόκου του ενζύμου. Ο διαχωρισμός της δόνησης νas(Fe-O-Fe) δηλώνει την ύπαρξη δύο διαφορετικών διαμορφώσεων (ανοικτή και κλειστή) στο καταλυτικό κέντρο του οξειδωμένου ενζύμου, ενώ η εγγύς ιστιδίνη δεν δεσμεύεται από τον αιμικό σίδηρο σε καμία από τις διαμορφώσεις αυτές. Η μετάβαση στην ανηγμένη μορφή του ενζύμου προκαλεί την δέσμευση της εγγύς ιστιδίνης στον σίδηρο της αίμης. O δεσμός αυτός διατηρείται και στο CO-σύμπλοκο του ανηγμένου ενζύμου, το οποίο είναι αριθμού συναρμογής έξι και χαμηλής διαμόρφωσης σπιν. Μελέτηκε επίσης η αντίδραση της οξειδωμένης και ανηγμένης μορφής της NOR με το NO με φασματοσκοπία συντονισμού Raman και FTIR, για τον χαρακτηρισμό ενδιαμέσων της καταλυτικής πορείας. Η αλληλεπίδραση του NO με την οξειδωμένη NOR έχει ως αποτέλεσμα τον σχηματισμό ενός συμπλόκου του ΝΟ με την αίμη b3 χαμηλού σπιν και αριθμού συναρμογής έξι, το οποίο προτείνουμε ότι αποτελεί ενδιάμεσο του καταλυτικού της αναγωγής του ΝΟ. Τα προϊόντα της αντίδρασης της ανηγμένης NOR με το μονοξείδιο του αζώτου, δείχνουν ότι ο σχηματισμός του δεσμού Ν-Ν κατά την αναγωγή του ΝΟ σε Ν2Ο στην διαδικασία της απονιτροποίησης πραγματοποιείται με ακέραιο τον δεσμό His-αίμης b3. Η αντίδραση της αναγωγής του Ο2 από την NOR, ως μακρινό μέλος της οικογένειας των τελικών οξειδασών, συγκρίθηκε με την αντίστοιχη αντίδραση του κυτoχρώματος cbb3 από το P. stutzeri, που παρουσιάζει την μεγαλύτερη ομολογία με την NOR. Μελετήθηκε επίσης η αντίδραση του ανηγμένου κυτοχρώματος με το ΝΟ. Το cbb3 παρουσιάζει την μέγιστη ενεργότητα αναγωγάσης του ΝΟ σε σχέση με τα υπόλοιπα μέλη της οικογένειας των τελικών οξειδασών. Η προσθήκη ΝΟ στο ένζυμο προκαλεί την διάσπαση του δεσμού της αίμης b3-His, με αποτέλεσμα τον σχηματισμό ενός συμπλόκου b3 2+-NO αριθμού συναρμογής πέντε. Προτάθηκε μοντέλο για την περιγραφή των καταστάσεων δέσμευσης του υποκαταστάτη και της οξείδωσης του ανηγμένου cbb3 μετά την προσθήκη του ΝΟ.
|
Συλλογές
