| Περίληψη |
Στην παρούσα ερευνητική εργασία συνδυάζοντας πρωτεομικές μεθόδους κλασματοποίησης με gel-free μεθόδους πρωτεομικής ανάλυσης (N-terminal COFRADIC και nLC-MS/MS) μελετήθηκε κυρίως η έκφραση αλλά και η τοπολογία των πρωτεϊνών του Chl. tepidum. Επιπλέον εξετάστηκαν τα απομονωμένα χλωροσώματα του Chl. tepidum, ως προς το μέγεθος τους με χρήση DLS και ηλεκτρονική μικροσκοπία και ως προς την πρωτεϊνική τους σύσταση χρησιμοποιώντας nLC-MS/MS.
To Chlorobium tepidum είναι ένα θερμόφιλο Gram-αρνητικό, πράσινο θειοβακτήριο (Chlorobia), είναι αποκλειστικά αναερόβιο φωτολιθοαυτότροφο και είναι διαδεδομένο σε υδατικά περιβάλλοντα, όπου ανοξικά στρώματα που περιέχουν ανηγμένες ενώσεις θείου εκτίθενται σε φως. Τα πράσινα θειοβακτήρια χρησιμοποιούν μοναδικά συστήματα για την συλλογή του φωτός, τα χλωροσώματα, στα οποία οι χρωστικές οργανώνονται σε σωληνοειδείς δομές, χωρίς να αλληλεπιδρούν με πρωτεΐνες.
Το βακτήριο αυτό αποτελεί οργανισμό μοντέλο για τη μελέτη των διεργασιών του μεταβολισμού θειούχων ενώσεων και της φωτοσύνθεσης. Προσφάτως, το γονιδίωμα του Chl. tepidum αναλύθηκε πλήρως και προβλέφθηκε οτι κωδικοποιεί 2288 γονίδια, αλλά η λειτουργία ενός μεγάλου αριθμού αυτών παραμένει άγνωστη. Πολλά γονίδια βρέθηκε ότι είναι σε μεγάλο βαθμό συντηρημένα μεταξύ των φωτοσυνθετικών οργανισμών με μη ξεκάθαρο ρόλο στο Chl. tepidum, αλλά αυτά τα γονίδια πιθανόν να έχουν συγκεκριμένους ρόλους στην φωτοσύνθεση και στην φωτοβιολογία. Επίσης, αν και μελέτες βασισμένες σε SDS-PAGE, ανοσοκαθήλωση και μοριακή βιολογία σε απομονωμένα χλωροσώματα του Chl. tepidum έχουν διαπιστώσει ότι τα χλωροσώματα περιέχουν 10 χλωροσωμικές πρωτεΐνες, δεν έχει διευκρινιστεί ακόμα η λειτουργία τους καθώς και η πρωτεϊνική σύνθεση των άθικτων χλωροσωμάτων.
Η ανάλυση και ο χαρακτηρισμός των γονιδιακών προϊόντων ενός κυττάρου, ιστού ή οργανισμού ορίζεται ως πρωτεομική ανάλυση (proteomics). Η πρωτεομική ανάλυση παρουσιάζει μεγάλο ερευνητικό ενδιαφέρον, παρά τους περιορισμούς που παρουσιάζει αναφορικά με την πολυπλοκότητα των δειγμάτων τα οποία καλείται να αναλύσει, των διαφορετικών φυσικοχημικών τους ιδιοτήτων και το μεγάλο εύρος των συγκεντρώσεων τους, καθότι οι πρωτεΐνες είναι υπεύθυνες για τον φαινότυπο των κυττάρων και οι λειτουργίες που επιτελούνται σε αυτά δεν είναι δυνατόν να διερευνηθούν μελετώντας αποκλειστικά το γονιδίωμα των κυττάρων.
Στην μελέτη αυτή, πραγματοποιήθηκε κλασματοποιήση του πρωτεόματος του Chl. tepidum και τα υποπρωτεόματα του κυτταροπλάσματος, του περιπλάσματος, των ολικών μεμβρανών καθώς και το κλάσμα του υδατοδιαλυτού τμήματος του βακτηρίου χαρακτηρίστηκαν με φασματοσκοπία απορρόφησης και Tricine SDS-PAGE και αναλύθηκαν με N-terminal COFRADIC, μια αναλυτική τεχνική που στοχεύει μέσω χημικών τροποποιήσεων και χρωματογραφικών μεθόδων στην επιλογή των Ν-τερματικών πεπτιδίων που προκύπτουν από τη θρυψινοποίηση του πρωτεϊνικού δείγματος πριν την ανάλυση τους με LC-MS/MS.
H N-terminal COFRADIC ανάλυση οδήγησε στην ταυτοποίηση 805 πρωτεϊνών εκ των οποίων με βάση την προβλεπόμενη [51-52] υποκυτταρική τοπολογία τους το μεγαλύτερο μέρος είναι κυτταροπλασματικές πρωτεϊνες, ενώ 277 απο τις ταυτοποιημένες πρωτεΐνες εμφανίστηκαν ως άγνωστης κυτταρικής τοπολογίας. Αναφορικά με την προβλεπόμενη λειτουργία τους [3], η πλειοψηφία των ταυτοποιημένων πρωτεϊνών δεν εμφανίζει γνωστή λειτουργία, ενώ το μεγαλύτερο μέρος των ταυτοποιημένων πρωτεϊνών γνωστής λειτουργίας εμπλέκεται στο μεταβολισμό της ενέργειας. Η ταυτοποίηση πολλών πρωτεϊνών σε επιμέρους πρωτεϊνικά κλάσματα και όχι στο σύνολο τους, ενισχύει την σημασία της κλασματοποίησης πολύπλοκών πρωτεομάτων καθώς και την σημασία της επιλογής μιας αντιπροσωπευτικής τάξης των προκύπτοντων πεπτιδίων όπως είναι τα Ν- τερματικά πεπτίδια προκειμένου να ταυτοποιηθεί όσο το δυνατόν μεγαλύτερο μέρος των πρωτεϊνών των πολύπλοκων αυτών δειγμάτων.
Επιπλέον, απομονώθηκε το χλωροσωμικό κλάσμα του Chl. Tepidum και χαρακτηρίστηκαν με φασματοσκοπία απορρόφησης, Tricine SDS-PAGE, ηλεκτρονική μικροσκοπία και δυναμική σκέδαση φωτός (DLS). Στην Tricine SDS-PAGE εμφανίστηκαν πρωτεϊνικές ζώνες που αντιστοιχούν σε περισσότερες από 20 πρωτεΐνες με μοριακά βάρη μεταξύ 6 kDa και 70 kDa. Με βάση τα αποτελέσματα της
ηλεκτρονικής μικροσκοπίας και της DLS, τα χλωροσώματα εμφανίζονται να έχουν μήκος 170 nm και 140 nm, αντίστοιχα. Επιπρόσθετα, η πρωτεϊνική σύσταση του απομονωμένου χλωροσωμικού κλάσματος μελετήθηκε με nLC-MS/MS, οδηγώντας στην ταυτοποίηση 270 πρωτεϊνών, στις οποίες συμπεριλαμβάνονται και οι 10 προβλεπόμενες απο το γονιδίωμα ως χλωροσωμικές πρωτεΐνες, καθώς και κάποιες επιπλέον πρωτεΐνες που προτείνεται [8, 12, 14] ότι αλληλεπιδρούν με τα χλωροσώματα.
Συνολικά, η πρωτεομική ανάλυση που πραγματοποιήθηκε στο Chl. tepidum οδήγησε στην ταυτοποίηση 891 πρωτεϊνών, δηλαδή του 38.94% επί του θεωρητικού πρωτεόματος του Chl. tepidum [3], που αποτελεί την ταυτοποίηση του μεγαλύτερου ποσοστού πρωτεϊνών επί του θεωρητικού πρωτεόματος του βακτηρίου αυτού που έχει αναφερθεί στη βιβλιογραφία.
|
Συλλογές
