| Περίληψη |
Η Sec μεταθετάση αποτελεί μια εξαιρετικά συντηρημένη, πολύπλοκη μοριακή μηχανή που συμμετέχει σε δύο βασικές βιολογικές διεργασίες: την ενσωμάτωση μεμβρανικών πρωτεΐνών στη λιπιδική διπλοστιβάδα και τη μετατόπιση πρωτεΐνικών υποστρωμάτων διαμέσου αυτής. Στα βακτήρια, το βασικό πυρήνα της μεταθετάσης αποτελεί το σύμπλοκο του SecYEG που σχηματίζει το κανάλι μετατόπισης. Δύο διακριτοί δρόμοι στόχευσης συναντιούνται στο κανάλι του SecYEG: η συμμεταφραστική και η μεταμεταφραστική μετατόπιση πρωτεϊνων. Κατά τη συμμεταφραστική ενσωμάτωση πολυπεπτιδίων, το ριβόσωμα προσδένεται στο κανάλι του SecYEG, ενώ στη μεταμεταφραστική μετατόπιση, η έναρξη της αντίδρασης μετατόπισης πυροδοτείται, εκτός των άλλων, από την αλληλεπίδραση της SecA με το σύμπλοκο του SecYEG. Τα τελευταία πέντε χρόνια, αξιόλογη πρόοδος έχει σημειωθεί στην κατανόηση του μηχανισμού μετατόπισης σε ατομική λεπτομέρεια. Σε αυτό συνέβαλε η λεπτομερής δομική πληροφορία, που προέκυψε από υψηλής ανάλυσης κρυσταλλικές δομές και μέτριας ανάλυσης δομές κρυο-ηλεκτρονιακής μικροσκοπίας, των συστατικών του μονοπατιού. Παραμένει, ωστόσο, πλήθος αναπάντητων ερωτημάτων όσον αφορά στην κατανόηση των αλληλεπιδράσεων μεταξύ διακριτών συστατικών του μονοπατιού και ειδικά στην αλληλεπίδραση ανάμεσα στη SecYEG και στη SecA. Η πρωτεΐνη-κινητήρας SecA προσδένεται στο κανάλι μετατόπισης του SecYEG. Το γεγονός αυτό διαδέχονται τοπικές αλλαγές στη διαμόρφωση της SecA. Οι αλλαγές αυτές μεταβιβάζονται στο κανάλι του SecYEG και το οδηγούν στην ανοικτή κατάσταση. Το πρωτεΐνικό υπόστρωμα εισέρχεται στο κανάλι ενώ σε μετέπειτα στάδια γίνεται ένθεση της SecA στο σύμπλοκο του SecYEG. Η αλληλεπίδραση ανάμεσα στη SecA και το σύμπλοκο του SecYEG έχει μελετηθεί εκτενώς, παρ’όλα αυτά λίγα είναι γνωστά για τις περιοχές του SecYEG που συμμετέχουν. Στην παρούσα εργασία, χρησιμοποιήθηκε η τεχνολογία των πεπτιδικών συστοιχιών για την ταυτοποίηση των περιοχών του SecYEG που αλληλεπιδρούν με τη SecA. Πειράματα πρόσδεσης που διεξήχθησαν στους 4οC υπέδειξαν τις κυτταροπλασματικές περιοχές C1, C2, C3, C4, C5, C6 καθώς και την περιπλασμική P3 και διαμεμβρανική ΤΜ9 ως πιθανές περιοχές αλληλεπίδρασης της SecY με τη SecA. Παράλληλα, SecY πεπτίδια που προσδένουν SecA στους 37οC χαρτογραφούνται σε περισσότερο εσωτερικές περιοχές στη δομή της πρωτεΐνης, που αντιστοιχούν στις διαμεμβρανικές περιοχές ΤΜ1, ΤΜ2b, ΤΜ3, ΤM6, TM7, TM8, TM9, TM10 και την περιπλασμική περιοχή P5 της SecY. Εντός αυτών των περιοχών επιλέχθηκαν συντηρημένα κατάλοιπα και υποβλήθηκαν σε μεταλλάξεις πολλών σημείων. Κάποια από τα μετ αλλάγματα εμφάνισαν σοβαρό πρόβλημα ανάπτυξης σε δοκιμασία γενετικής συμπληρωματικότητας. Επιπλέον, πειράματα ελέγχου απέκλεισαν την περίπτωση ο προβληματικός φαινότυπος των μετ αλλαγμάτων να οφείλεται σε ανεπαρκή έκφραση ή σε μη σωστή ενσωμάτωση των μεταλλαγμένων πρωτεϊνών στη μεμβράνη. Προτείνουμε ότι οι μεταλλάξεις αυτές εντοπίζονται σε περιοχές που πιθανά συμμετέχουν στην αλληλεπίδραση της SecA με τη SecYEG.
|
Συλλογές
