E-Locus - Ιδρυματικό Καταθετήριο Πανεπιστημίου Κρήτης - Μεταπτυχιακές εργασίες ειδίκευσης

Αρχική Συλλογές Τύπος Εργασίας Μεταπτυχιακές εργασίες ειδίκευσης

Μεταπτυχιακές εργασίες ειδίκευσης

Εντολή Αναζήτησης : Συγγραφέας="Κούτρα" Και Συγγραφέας="Αικατερίνη"

Τρέχουσα Εγγραφή: 9 από 6511

[Προσθήκη στο καλάθι]

Κωδικός Πόρου

000461904

Τίτλος

Towards more active and stable BVMOs via protein engineering

Άλλος τίτλος

Στοχεύοντας σε πιο ενεργές και σταθερές μονοοξυγενάσες μέσω πρωτεϊνικής μηχανικής

Συγγραφέας

Μιχαλοπούλου, Χριστίνα Δ.

Σύμβουλος διατριβής

Παυλίδης, Ιωάννης

Μέλος κριτικής επιτροπής

Παυλίδης, Παύλος
Ελευθεριάδης, Νικόλαος

Περίληψη

Οι Baeyer-Villiger μονοοξυγενάσες (BVMOs, EC 1.14.13.X) προσφέρουν μία «πράσινη» εναλλακτική για τη σύνθεση λακτονών από κετόνες. Στα μειονεκτήματά τους είναι η αστάθεια που παρουσιάζουν κάτω από συνθήκες θερμικού και οξειδωτικού στρες. Μία επιπλέον πρόκληση κατά τη διεργασία των BVMOs είναι η παραγωγή του H₂O₂ αντί του σχηματισμού προϊόντος μέσω ενός κύκλου αντίδρασης αποσύζευξης ή όπως αναφέρεται στην βιβλιογραφία, αντίδρασης uncoupling. Η μελέτη αυτή εστιάζει στην προσπάθεια σταθεροποίησης της 2-oxo-D3-4,5,5-trimethylcyclopentenylacetylCoA μονοοξυγενάσης που προέρχεται από το βακτήριο Pseudomonas putida (OTEMO). Ως πρώτη προσέγγιση της ομάδας μας αποτέλεσε η χρήση της στρατηγικής του ορθολογικού σχεδιασμού μεταλλάξεων. Στόχος της μεταλλαξιγένεσης αποτέλεσαν τα αμινοξέα του ενεργού κέντρου τα οποία είναι επιρρεπή στην οξείδωση και συγκεκριμένα η κυστεΐνη στη θέση 444 μεταλλάχθηκε σε σερίνη. Αυτή η προσπάθεια βελτίωσε την θερμική σταθερότητα και αύξησε την ειδική ενεργότητα του ενζύμου κατά 1.5 φορά σε σχέση με την ΟΤΕΜΟ αγρίου τύπου. Ταυτόχρονα, όμως, το μετάλλαγμα εμφάνισε μειωμένη οξειδωτική σταθερότητα και αυξημένο ποσοστό uncoupling. Για τον περιορισμό αυτών των μειονεκτημάτων, στην παρούσα μεταπτυχιακή εργασία έγινε χρήση της στρατηγικής της κατευθυνόμενης εξέλιξης μέσω τυχαίας εισαγωγής μεταλλάξεων και συγκεκριμένα με επιρρεπή-στα-λάθη αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (epPCR). Η μεταλλαξιγένεση αυτή πραγματοποιήθηκε στην ΟΤΕΜΟ_C444S, ως σταθερότερο ικρίωμα το οποίο είναι πιθανότερο να βελτιστοποιηθεί περαιτέρω οδηγώντας σε νέα λειτουργικά μεταλλάγματα. Για το σκοπό αυτό, δημιουργήθηκαν αρκετές βιβλιοθήκες μεταλλαγμάτων και επιλέχθηκε η βέλτιστη έπειτα από αξιολόγηση. Από αυτήν, ~800 κλώνοι ελέγχθηκαν για αυξημένη ενεργότητα και σταθερότητα έναντι του H₂O₂ και εντοπίστηκαν μεταλλάγματα με βελτιωμένο επίπεδο έκφρασης (κατά 1.5 με 3 φορές) και αυξημένη οξειδωτική σταθερότητα. Το μετάλλαγμα OTEMO_C444S/K155E έδειξε την μεγαλύτερη βελτίωση όσον αφορά την οξειδωτική σταθερότητα διατηρώντας την ενεργότητά του κατά 20% περισσότερο σε τελικές συγκεντρώσεις 5- 25 mM H₂O₂ σε σχέση με την ΟΤΕΜΟ_C444S. Ωστόσο, η θερμική του σταθερότητα μειώθηκε αφού μετά από 24 ώρες στους 35℃ δεν ήταν ενεργό. Επιπλέον το μετάλλαγμα OTEMO_C444S/D375G έδειξε μείωση στο ποσοστό uncoupling κατά 3 φορές σε σχέση με την ΟΤΕΜΟ_C444S, χωρίς όμως να έχει τη μεγαλύτερη βελτίωση στον έλεγχο της οξειδωτικής σταθερότητας. Η παρατήρηση αυτή δεν δείχνει την άμεση συσχέτιση μεταξύ του ποσοστού uncoupling και της οξειδωτικής σταθερότητας. Και οι 2 θέσεις μεταλλαξιγένεσης βρίσκονται μακριά από το ενεργό κέντρο του ενζύμου. Τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαίωσαν ότι η epPCR ήταν ένα αποτελεσματικό εργαλείο για την εύρεση απομακρυσμένων μεταλλάξεων από το ενεργό κέντρο για την σταθεροποίηση βιομηχανικών ενζύμων, κάτι το οποίο δύσκολα θα μπορούσε να επιτευχθεί με τον ορθολογικό σχεδιασμό μεταλλάξεων.

Φυσική περιγραφή

74 σ. : πίν., σχήμ., εικ. (μερ. εγχρ.) ; 30 εκ.

Γλώσσα

Αγγλικά

Θέμα

Error-prone PCR

Monooxygenases

Stability

Thermal stability

Επιρρεπή-στα-λάθη αλυσιδωτή αντίδραση πολυεράσης

Θερμοσταθερότητα

Πρωτεϊνική μηχανική