| Περίληψη |
Η παρούσα διατριβή αναφέρεται στο πρόβλημα της παρουσίας των μυκοτοξικώσεων και των μυκοτοξινών στα τρόφιμα, στην ανίχνευση των μυκοτοξινών, στην διερεύνηση της προστασίας των τροφίμων με τη δημιουργία νέων βιοσυμβατών πολυμερικών ουσιών με στόχο την αναστολή της ανάπτυξης των μυκήτων σε αυτά όπως επίσης και τη δημιουργία χημειοθεραπευτικών ελεγχόμενης απόδοσης που μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε περιπτώσεις μυκητιάσεων. Η διδακτορική διατριβή περιλαμβάνει τρεις ενότητες. Στην πρώτη ενότητα διερευνώνται οι συνθήκες ανίχνευσης, ταυτοποίησης και ποσοτικού προσδιορισμού μυκοτοξινών και συγκεκριμένα των αφλατοξινών Β1, Β2, G1, G2, Μ1 και Μ2 με χρωματογραφικές τεχνικές, όπως χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας (TLC) και υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC). Το σύστημα διαλύτη ανάπτυξης των αφλατοξινών σε πλάκα TLC που επιλέχθηκε ως βέλτιστο είναι χλωροφόρμιο-ακετόνη (9:1). Τα όρια ανίχνευσης πρότυπων διαλυμάτων αφλατοξινών με TLC είναι 8 ng για την Β1, 10 ng για τις Β2, G1, M2 και 15-20 ng για τις G2 και Μ1. Ως διαλύτης έκλουσης των αφλατοξινών σε σύστημα υγρής χρωματογραφίας χρησιμοποιήθηκε το μίγμα διαλυτών που αποτελείται από 50% v/v νερό, 30% v/v ακετονιτρίλιο και 20% v/v μεθανόλη ενώ η ανίχνευση τους γίνεται στα 365 nm. Ο χρόνος έκλουσης της αφλατοξίνης Β1 κάτω από αυτές τις συνθήκες είναι τα 10.30 min, της αφλατοξίνης Β2 τα 8.93 min, της αφλατοξίνης G1 τα 8.01 min και της αφλατοξίνης G2 τα 7.21 min, με όριο ανίχνευσης της Β1 τα 50 ng/ml, της Β2 τα 150 ng/ml, της G1 τα 100 ng/ml και της G2 τα 250 ng/ml. Αναπτύχθηκαν δύο διαφορετικά πρωτόκολλα ανίχνευσης και ποσοτικού προσδιορισμού των αφλατοξινών B1, B2, G1 και G2. Τα πρωτόκολλα αυτά μπορούν να εφαρμοστούν με επιτυχία σε τροφές όπως καλαμπόκι και σόγια καθώς και σε μίγματα τροφών με κύρια συστατικά τις παραπάνω τροφές. Η χρήση της TLC στην Α μέθοδο αποσκοπεί στον περαιτέρω καθαρισμό των δειγμάτων και στον ποιοτικό έλεγχο των τροφών ενώ ο ποσοτικός προσδιορισμός και στις δύο μεθόδους πραγματοποιείται με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης. Τα όρια ανίχνευσης των αφλατοξινών και στις δύο μεθόδους κυμαίνονται στα 4-5 ng/g τροφής για τις αφλατοξίνες Β1 και G1, 6 και 8 ng/g τροφής για τις αφλατοξίνες Β2 και G2, με μέση ανάκτηση 62.17% για την μέθοδο Α και 73.39% για την μέθοδο Β. Η δεύτερη ενότητα αναφέρεται στην σύνθεση νέων πολυμερικών υδατοδιαλυτών μυκοστατικών και αντιμυκητιασικών συστημάτων και στην μελέτη της δομής και των φυσικοχημικών ιδιοτήτων τους. Τα συστήματα αυτά είναι πολυμερικά παράγωγα, ελεγχόμενης απόδοσης, που έχουν ως βάση ήδη γνωστές ουσίες με μυκοστατική και αντιμυκητιασική δράση όπως είναι το σορβικό οξύ, η νυστατίνη και η αμφοτερικίνη Β. Η τροποποίηση των παραπάνω βιολογικά δραστικών ουσιών έγινε με σκοπό την βελτίωση της βιολογικής δράσης, των φυσικοχημικών ιδιοτήτων αυτών, την μείωση της τοξικότητας όπως και την βιοσυμβατότητας αυτών. Παρασκευάστηκαν πολυμερικοί εστέρες του σορβικού οξέος με την πολυβινυλπυρρολιδόνη μοριακού βάρους 10*103, 40*103 και 360*103 όπου το σορβικό οξύ είναι συνδεδεμένο πάνω στη PVP με ομοιοπολικό δεσμό. Η εκατοστιαία περιεκτικότητα του σορβικού οξέος στους πολυμερικούς εστέρες κυμαίνεται από 3.4-5.1%. Επίσης παρασκευάστηκαν δύο σειρές συμπλόκων του σορβικού οξέος με τη πολυβινυλπυρρολιδόνη μοριακού βάρους 10*103, 25*103, 30*103, 40*103, 90*103, και 360*103. Στα σύμπλοκα αυτά το σορβικό οξύ συνδέεται με την PVP με δεσμό υδρογόνου. Σύμφωνα με την πρώτη μέθοδο (1η σειρά συμπλόκων) η περιεκτικότητα σε σορβικό οξύ κυμαίνεται από 2.5 μάζες % έως 5.5 μάζες %, ενώ στην δεύτερη μέθοδο (2η σειρά συμπλόκων) η μέγιστη περιεκτικότητα για όλα τα σύμπλοκα είναι 50 μάζες %. Επίσης παρασκευάστηκαν σύμπλοκα της νυστατίνης και της αμφοτερικίνης Β ακολουθώντας παρόμοια πρωτόκολλα. Η μέγιστη % περιεκτικότητα της νυστατίνης στα σύμπλοκα αυτής κυμαίνεται από 0.25 έως 0.5 μάζες % ενώ της αμφοτερικίνη από 0.167 έως 0.333 %. Όλα τα πολυμερικά παράγωγα του σορβικού οξέος, της νυστατίνης και της αμφοτερικίνης Β είναι υδατοδιαλυτά. Η μελέτη της δομής και των φυσικοχημικών ιδιοτήτων των πολυμερικών συμπλόκων του σορβικού οξέος πραγματοποιήθηκε με μελέτη του εσωτερικού ιξώδους και της διαπερατότητας τους και με υπέρυθρη φασματοσκοπία. Σκοπός της μελέτης ήταν να προσδιοριστεί η επίδραση του μοριακού βάρους της πολυβινυλπυρρολιδόνης στην δημιουργία και στην σταθερότητα του συμπλόκου, η επίδραση του οργανικού διαλύτη στην δημιουργία του συμπλόκου, το είδος δεσμού μεταξύ σορβικού οξέος και πολυβινυλπυρρολιδόνης, οι αλλαγές στις φυσικοχημικές ιδιότητες της πολυβινυλπυρρολιδόνης και του σορβικού οξέος με την δημιουργία του συμπλόκου. Διαπιστώθηκε ότι με τη μείωση του μοριακού βάρους της πολυβινυλπυρρολιδόνης είναι πιο εύκολη η δημιουργία δεσμού μεταξύ σορβικού οξέος και της πολυβινυλπυρρολιδόνης. Επίσης διαπιστώθηκε ευκολότερη δημιουργία συμπλόκων σε οργανικό διαλύτη όπου η πολυβινυλπυρρολιδόνη έδωσε μεγάλες τιμές εσωτερικού ιξώδους. Η τιμή του εσωτερικού ιξώδους στα παραγόμενα σύμπλοκα του σορβικού οξέος παραμένει σταθερή με την αύξηση της συγκέντρωσης, κάτι που συνδέθηκε με την δημιουργία δεσμού υδρογόνου και επιβεβαιώνει την αλληλεπίδραση του σορβικού οξέος και της πολυβινυλπυρρολιδόνης. Τα φάσματα υπέρυθρης φασματοσκοπίας (IR) αποδεικνύουν ότι η αλυσίδα του σορβικού οξέος έχει γραμμική διαμόρφωση χωρίς την παρουσία κυκλικών διμερών ενώ τα π ηλεκτρόνια του καρβονυλίου είναι σε σύζευξη με τα π ηλεκτρόνια των διπλών δεσμών του οξέος. Η παρουσία ελεύθερου οξέος στα σύμπλοκα μειώνεται όσο αυξάνει το μοριακό βάρος του συμπλόκου κάτι που σημαίνει ότι η εντατικοποίηση της δημιουργίας του συμπλόκου είναι συνάρτηση του μοριακού βάρους της PVP. Σημαντική είναι η παρουσία ή μη νερού στην κρυσταλλική PVP. Διαπιστώθηκε ότι με την αύξηση της περιεκτικότητας του νερού στην PVP αυξάνεται ανάλογα και το ποσοστό του ελεύθερου σορβικού οξέος στα σύμπλοκα. Η αλληλεπίδραση σορβικού οξέος και PVP με δεσμό υδρογόνου εξακριβώνεται από την παρουσία απορρόφησης στην περιοχή των 2400-2600 κυματάρυθμων που είναι ενδεικτική της παρουσίας δεσμευμένου υδροξυλίου. Τέλος στην τρίτη ενότητα πραγματοποιείται έλεγχος και σύγκριση της μυκοστατικής δράσης ουσιών που χρησιμοποιούνται σαν πρόσθετα σε τρόφιμα και τροφές όπως το σορβικό οξύ, το προπιονικό οξύ, το οξικό οξύ, το μυρμηκικό οξύ, το σορβικό κάλιο και η δευτεροταγής βουτυλαμίνη έναντι στον δυνητικά παθογόνο για τον άνθρωπο και τα ζώα μύκητα Fusarium oxysporum radicis-cucumerinum και στους παθογόνους μύκητες Aspergillus parasiticus, Penicillium viridicatum, Candida albicans και Candida tropicalis. Τα παραπάνω οξέα έχουν αντιβακτηριακή και μυκοστατική δράση ενώ πρόσφατες έρευνες έχουν δείξει ότι το σορβικό και το προπιονικό οξύ αναστέλλουν την βιοσύνθεση των μυκοτοξινών από του μύκητες. Τα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι από τα παραπάνω οξέα το πιο δραστικό είναι το σορβικό οξύ, ακολουθεί το σορβικό κάλιο, το προπιονικό οξύ, η δευτεροταγής βουτυλαμίνη, το οξικό οξύ και τέλος το μυρμηκικό οξύ. Η σειρά αυτή ταυτίζεται με την σειρά μείωσης των μοριακών βαρών των οργανικών οξέων ενώ το σορβικό οξύ εμφανίζεται δραστικότερο του άλατος (σορβικού καλίου) αυτού. Τα προβλήματα που εμφανίζονται στην χρήση του σορβικού οξέος εντοπίζονται στην μειωμένη διαλυτότητα του στο νερό σε σχέση με τα άλλα οργανικά οξέα και άλατα. Θα πρέπει όμως να τονιστεί ότι αποτελεί ένα πολύ καλό μυκοστατικό παράγοντα όχι μόνο λόγω της καλής βιολογικής δράσης του αλλά και της μικρής τοξικότητας στον άνθρωπο και στα ζώα. Παρόμοια προβλήματα εμφανίζονται και στην χρήση της νυστατίνης, της αμφοτερικίνης Β και των αζολών, η διαλυτότητα των οποίων στο νερό είναι πολύ μικρή. Η δραστικότητα των πολυμερικών συμπλόκων του σορβικού οξέος αποδεικνύεται πολύ καλύτερη από την αντίστοιχη των πολυμερικών εστέρων. Η δράση τόσο των συμπλόκων όσο και των πολυμερικών εστέρων αυξάνεται με την μείωση του μοριακού βάρους. Το σύμπλοκο με μοριακό βάρος 10*103 έδωσε την μεγαλύτερη βλαστική αναστολή έναντι στον μύκητα Fusarium oxysporum σε σχέση με την αντίστοιχη του σορβικού οξέος, του σορβικού καλίου αλλά και των άλλων μυκοστατικών που εξετάστηκαν. Παρόμοιος έλεγχος έγινε και για ήδη γνωστές ουσίες με αντιμυκητιασική δράση όπως η νυστατίνη και η αμφοτερικίνη Β, οι οποίες ανήκουν στα κατηγορία των πολυενίων, η κλοτριμαζόλη, η εκοναζόλη και η μικοναζόλη οι οποίες ανήκουν στα αντιμυκητιασικά της κατηγορίας των αζολών και χρησιμοποιούνται σε περιπτώσεις μυκητιάσεων. Η βιολογική δράση των αζολών έναντι στον μύκητα Fusarium oxysporum είναι γενικά καλύτερη από εκείνη των πολυενίων όσο αφορά την βλαστική αναστολή. Η δραστικότητα τους ακολουθεί την σειρά εκοναζόλη, κλοτριμαζόλη, μικοναζόλη, αμφοτερικίνη Β και νυστατίνη. Η νυστατίνη δείχνει να είναι λιγότερο δραστική από τις ουσίες που εξετάστηκαν όμως είναι ο μοναδικός αντιμυκητιασικός παράγοντας που χρησιμοποιείται στην κτηνιατρική στην χώρα μας. Έναντι στη βλάστηση των σπορίων του Fusarium η νυστατίνη αποδεικνύεται δραστικότερη από την αμφοτερικίνη Β ενώ καμιά επίδραση δεν παρουσίασαν τα αντιμυκητιασικά της σειράς των αζολών. Τα πολυμερικά σύμπλοκα της νυστατίνης παρουσιάζουν καλύτερη βιολογική δράση σε σχέση με την πρότυπη νυστατίνη σε υδατικό διάλυμα όσο αφορά την βλαστική ανάπτυξη του μύκητα Fusarium oxysporum. Η δράση των συμπλόκων της νυστατίνης έναντι στη βλάστηση των σπορίων είναι συνάρτηση του μοριακού βάρους με το σύμπλοκο 6 να παρουσιάζεται 25.36 φορές δραστικότερο της νυστατίνης. Η αποτελεσματική βιολογική δράση των συμπλόκων του σορβικού, της νυστατίνης και της αμφοτερικίνης Β επιβεβαιώθηκε και έναντι σε παθογόνους μύκητες όπως ο Aspergillus parasiticus, Penicillium viridicatum, Candida albicans και Candida tropicalis. Τα σύμπλοκα 1, 2 και 3 του σορβικού οξέος έδωσαν υψηλότερες MICs (Minimum Inhibitory Concentration) τιμές από το σορβικό οξύ καθώς και από το σορβικό κάλιο. Συγκεκριμένα, το σύμπλοκο 1 του σορβικού οξέος αποδεικνύεται 3 φορές δραστικότερο από το σορβικό οξύ και 4 φορές δραστικότερο από το σορβικό κάλιο έναντι στο μύκητα Aspergillus parasiticus και 2.5 και 3.75 φορές αντίστοιχα έναντι στο μύκητα Penicillium viridicatum. Δραστικότερο αποδεικνύεται επίσης το σύμπλοκο 1 από το σορβικό οξύ έναντι στους μύκητες Candida albicans και Candida tropicalis. Το σύμπλοκο 1 αποδεικνύεται μυκητοκτόνο έναντι στον μύκητα Candida albicans σε αντίθεση με το σορβικό οξύ και τα άλλα σύμπλοκα του σορβικού οξέος με μεγαλύτερο μοριακό βάρος. Η δράση όλων των συμπλόκων του σορβικού οξέος είναι συνάρτηση της μακροδομής και αυξάνει με την μείωση του μοριακού βάρους. Τα σύμπλοκα της αμφοτερικίνης και της νυστατίνης έδωσαν παρόμοια βιολογική δράση με την αμφοτερικίνη και την νυστατίνη αντίστοιχα. Οι MICs τιμές των συμπλόκων μειώνονται με την μείωση του μοριακού τους βάρους γεγονός που επιβεβαιώνει την σχέση της βιολογικής δράσης με την μακροδομή και δικαιολογεί τον χαρακτηρισμό αυτών ως χημειοθεραπευτικά ελεγχόμενης απόδοσης. Στα πλεονεκτήματα των πολυμερικών συμπλόκων του σορβικού οξέος, της νυστατίνης και της αμφοτερικίνης Β μπορούμε περιληπτικά να αναφέρουμε την μεγάλη διαλυτότητα αυτών στο νερό, την δυνατότητα τροποποίησης της βιολογικής δράσης μέσω της μακροδομή τους, την επίτευξη της βιοσυμβατότητας και την αποτελεσματικότερη μυκοστατική δράση τους σε σχέση με τις πρότυπες ουσίες. Τα πολυμερικά παράγωγα του σορβικού οξέος μπορούν να χρησιμοποιηθούν είτε ως πρόσθετα σε τροφές για την μείωση της παρουσίας βακτηριδίων, μικροβίων, μυκήτων και μυκοτοξινών είτε ως χημειοθεραπευτικοί παράγοντες. Τα πολυμερικά σύμπλοκα της νυστατίνης και της αμφοτερικίνης μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως χημειοθεραπευτικά για την μείωση του αποικισμού του γαστρεντερικού σωλήνα από Candida ή άλλους δυνητικά παθογόνους μύκητες σε ασθενείς ευαίσθητους σε μυκητιάσεις (ανοσοκατεσταλμένους, καρκινοπαθείς, κ.α.) ή σε περιπτώσεις μυκητίασης από παθογόνους υφομύκητες όπως Aspergillus και Penicillium.
|
Συλλογές
