E-Locus - Ιδρυματικό Καταθετήριο Πανεπιστημίου Κρήτης

Αρχική Αναζήτηση

Αποτελέσματα - Λεπτομέρειες

Εντολή Αναζήτησης : Συγγραφέας="Αϊβαλιώτης" Και Συγγραφέας="Μιχάλης"

Τρέχουσα Εγγραφή: 2 από 5

[Προσθήκη στο καλάθι]

Κωδικός Πόρου

000419740

Τίτλος

Identification and heterologous expression of CspAI restriction and modification system

Άλλος τίτλος

Ταυτοποίηση και ετερόλογη έκφραση του συστήματος για το περιοριστικό ένζυμο CspAI

Συγγραφέας

Μακρή, Ιωάννα Γ.

Σύμβουλος διατριβής

Κουτσιούλης, Δημήτρης

Μέλος κριτικής επιτροπής

Κοκκινίδης, Μιχαήλ
Αϊβαλιώτης, Μιχάλης

Περίληψη

Οι περιοριστικές ενδονουκλεάσες είναι ένζυμα τα οποία αναγνωρίζουν και κόβουν μία συγκεκριμένη αλληλουχία DNA. Ο βιολογικός τους ρόλος είναι η προστασία του οργανισμού-ξενιστή από την εισβολή ενός ξένου DNA. Για να προστατευτεί το γενετικό υλικό του ξενιστή, εκφράζονται ένζυμα που τροποποιούν το DNA, οι μεθυλοτρανσφεράσες. Αυτά τα ένζυμα μεθυλιώνουν συγκεκριμένες αλληλουχίες DNA και τις προστατεύουν από την πέψη με τα αντίστοιχα περιοριστικά ένζυμα. Μία περιοριστική ενδονουκλέαση και η μεθυλοτρανσφεράση συνυπάρχουν και συνιστούν ένα RM (Restriction-Modification) σύστημα. Οι περιοριστικές ενδονουκλεάσες που αναγνωρίζουν την ίδια αλληλουχία αλλά προέρχονται από διαφορετικά βακτηριακά στελέχη ονομάζονται ισοσχιζομερή. Πολλά ζεύγη ισοσχιζομερών διαφέρουν στην ευαισθησία τους στην μεθυλίωση. Για παράδειγμα, η CspAI και η AgeI αναγνωρίζουν την αλληλουχία 5’-A/CCGGT-3’. Όταν η υπογραμμισμένη κυτοσίνη είναι μεθυλιωμένη, η CspAI κόβει το DNA σε αντίθεση με την AgeI της οποίας η δράση αναστέλλεται. Ο τελικός μας στόχος είναι να συγκρίνουμε για πρώτη φορά τις κρυσταλλικές δομές των ισοσχιζομερών με διαφορετική ευαισθησία στη μεθυλίωση ώστε να προσδιορίσουμε τα κρίσιμα κατάλοιπα όσων αφορά την ευαισθησία στη μεθυλίωση. Αυτά τα δεδομένα θα βοηθήσουν τις μελλοντικές έρευνες στον λογικό σχεδιασμό των DNA-τροποποιητικών ενζύμων. Η παρούσα εργασία εστιάζεται στον προσδιορισμό, την κλωνοποίηση και την έκφραση των συστατικών του CspAI RM συστήματος. Αρχικά, η αλληλούχιση ολόκληρου του γονιδιώματος του βακτηριακού στελέχους Corynebacterium αποκάλυψε τις αλληλουχίες DNA του περιοριστικού ενζύμου R.CspAI και της μεθυλοτρανσφεράσης M.CspAI. Και τα δύο γονίδια κλωνοποιήθηκαν και εκφράστηκαν σε επιλεγμένα στελέχη E.coli και η έκφραση της πρωτεΐνης R.CspAI ταυτοποιήθηκε με Western blot. Οι στοιχίσεις πρωτεϊνικών αλληλουχιών τoυ περιοριστικού ενζύμου CspAI με άλλες πρωτεΐνες έδειξαν ότι έχει τα ίδια κατάλοιπα στον καταλυτικό πυρήνα με την AgeI και ως εκ τούτου έχει το μοτίβο PD-(D/E)-XK. Περαιτέρω πειράματα θα αποκαλύψουν εάν ακολουθεί τον ίδιο μηχανισμό πέψης με την AgeI, ο οποίος είναι μοναδικός ανάμεσα στις Type IIP περιοριστικές ενδονουκλεάσες. Η αλληλουχία της μεθυλοτρανσφεράσης CspAI συγκρίθηκε με άλλες μεθυλοτρανσφεράσες, ψάχνοντας για συντηρημένα και χαρακτηριστικά μοτίβα και έδειξε υψηλή ομοιότητα με N4-N6 μεθυλοτρανσφεράσες. 6 Summary Restriction endonucleases (REs) are enzymes which recognize and cleave a specific DNA sequence. Their biological function is to protect the host organism from invading DNA. In order to protect host’s genomic DNA, DNA modification enzymes are expressed, methyltransferases (MT). These enzymes methylate specific DNA sequences and protect them from respective REs cleavage. RE and MT coexist and compose a RM system. REs that recognize the same sequence but origin from different bacterial strains are called isoschizomers. Many isoschizomer pairs differ in their methyl-sensitivity. For example, CspAI and AgeI recognize sequence 5’-A/CCGGT-3’. When the underlined cytosine is methylated, CspAI cleave the DNA in contrast with AgeI that is blocked. Our ultimate goal is to compare for the first time the crystal structures of isoschizomers with different methyl sensitivity in order to identify the critical residues regarding methylation sensitivity. This data will help future studies on rational design of DNA modifying enzymes. Current thesis focuses on identification, cloning and expression of CspAI RM system components. Primarily, whole genome sequencing of Corynebacterium revealed the DNA sequences of R.CspAI and M.CspAI. Both genes were cloned and expressed in selected E.coli strain and R.CspAI expression was verified by western blot. Protein alignments of R.CspAI have demonstrated that it shares identical residues of the catalytic core with R.AgeI and hence, possesses the PD-(D/E)-XK motif. Further experiments will reveal if it has adapted the same cleavage mechanism with R.AgeI which is unique among Type IIP REs. M.CspAI sequence was compared against several MTs searching for conserved and characteristic motifs and showed higher similarities with N4-N6 MTs.

Φυσική περιγραφή

56 φύλλα : σχεδ., πίν., εικ.(μερ. εγχρ.) ; 30 εκ.

Γλώσσα

Αγγλικά

Θέμα

R-M systems

Ημερομηνία έκδοσης

2018-11-23

Συλλογή

Σχολή/Τμήμα--Σχολή Θετικών και Τεχνολογικών Επιστημών--Τμήμα Βιολογίας--Μεταπτυχιακές εργασίες ειδίκευσης

Τύπος Εργασίας--Μεταπτυχιακές εργασίες ειδίκευσης

Μόνιμη Σύνδεση