| Περίληψη |
Τα αυτοάνοσα νοσήματα προκαλούνται ως συνέπεια διαταραχών της ανοσολογικής ανοχής του οργανισμού
έναντι αυτοαντιγόνων. Σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση των αυτοδραστικών Τ λεμφοκυττάρων στην
περιφέρεια έχει η οικογένεια των Β7/CD28 μεμβρανικών υποδοχέων. Οι υποδοχείς αυτοί ενεργοποιούνται
μετά από πρόσδεση ειδικών συνδετικών μορίων και διαβιβάζουν σήματα ενεργοποίησης ή καταστολής των Τ
λεμφοκυττάρων. Η ισορροπία μεταξύ «θετικών» και «αρνητικών» σημάτων ενεργοποίησης καθορίζει τελικά
τη δραστικότητα των λεμφοκυττάρων και προστατεύει από την ανάπτυξη αυτοανοσίας. Ο υποδοχέας PD-1
επάγεται στην κυτταρική επιφάνεια ενεργοποιημένων Τ λεμφοκυττάρων και αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό
και την έκκριση φλεγμονωδών κυτταροκινών. Η ενεργοποίηση του PD-1 πραγματοποιείται μέσω ειδικών
συνδετών (PD-1 ligand 1 [PD-L1], PD-L2) που εκφράζονται κυρίως σε αντιγονο-παρουσιαστικά κύτταρα.
Πειράματα σε ζωικά πρότυπα έχουν αναδείξει το σημαντικό ρόλο του PD-1 στη ρύθμιση της
αυτοδραστικότητας και στην ανάπτυξη αυτοανοσίας.
Η ρευματοειδής αρθρίτιδα (ΡΑ) αποτελεί την πρότυπη φλεγμονώδη αυτοάνοση αρθρίτιδα στον άνθρωπο και
χαρακτηρίζεται από χρόνια συστηματική φλεγμονή και καταστροφή διαφόρων ιστών. Τα παθογενετικά
χαρακτηριστικά της ΡΑ είναι η παρουσία αυτοδραστικών Τ λεμφοκυττάρων στην περιφέρεια και τους
προσβεβλημένους ιστούς, η υπερπαραγωγή αυτοαντισωμάτων από τα Β λεμφοκύτταρα και οι αυξημένες
συγκεντρώσεις φλεγμονωδών κυτταροκινών.
Ο κύριος στόχος της παρούσας μελέτης ήταν να διερευνηθεί ο ρόλος του PD-1 και των συνδετών του στη
ρύθμιση των Τ λεμφοκυττάρων που συμμετέχουν στην παθογένεια της αρθρικής βλάβης της ρευματοειδούς
αρθρίτιδας.
Α. Μελέτες σε ανθρώπους:
Εξετάστηκαν 86 ασθενείς με ΡΑ και 227 υγιείς εθελοντές για την παρουσία του PD1.3 μονονουκλεοτιδικού
πολυμορφισμού με τεχνική PCR και χρήση ειδικής νουκλεάσης περιορισμού (PCR-based restriction fragment
length polymorphism analysis). 9ε διαπιστώθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά στη συχνότητα του
πολυμορφισμού μεταξύ ασθενών και υγιών μαρτύρων (15,1% vs 19,4%, p>0,05).
Για να διερευνήσουμε τη συμμετοχή του PD-1 στη ρύθμιση των Τ λεμφοκυττάρων στο σημείο της
φλεγμονής, μελετήσαμε με ανοσοϊστοχημεία την έκφραση του PD-1/PD-L1 σε βιοψίες αρθρικού υμένα από
υγιείς, ασθενείς με οστεοαρθρίτιδα (ΟΑ) και ΡΑ. 9ιαπιστώθηκε αυξημένη έκφραση του PD-1, κυρίως από Τ
CD3+ κύτταρα, σε 8 από τα 9 (89%) δείγματα αρθρικού υμένα ΡΑ, σε σχέση με 2 από τα 8 (25%) και
κανένα από τα 9 (0%) δείγματα ΟΑ και υγιούς αρθρικού υμένα αντίστοιχα. Έκφραση του PD-L1, κυρίως από
μακροφάγα, ανιχνεύθηκε στις βιοψίες από ΡΑ και ΟΑ ενώ στα δείγματα υγιούς ιστού η έκφρασή του ήταν
9
μηδαμινή. Επιπλέον, ο βαθμός της έκφρασης των PD-1/PD-L1 ήταν ανάλογος του βαθμού της φλεγμονής.
Τα ανωτέρω υποδεικνύουν πιθανή συμμετοχή του PD-1/PD-L1 στη ρύθμιση των φλεγμονωδών Τ
κυτταρικών αποκρίσεων σε ιστικό επίπεδο. Στη συνέχεια, μονοπύρηνα κύτταρα αρθρικού υγρού (SFMCs)
απομονώθηκαν από ασθενείς με ΡΑ και ΟΑ και μελετήθηκε η έκφραση των PD-1 και PD-L1 στα CD4+
κύτταρα με κυτταρομετρία ροής. Σε αντιστοιχία με τα αποτελέσματα της ανοσοϊστοχημείας, βρέθηκε
αυξημένη έκφραση του PD-1 στα Τ κύτταρα ΡΑ (24 ± 5% vs. 4 ± 1%, p=0.003), ιδιαίτερα στους
ενεργοποιημένους υποπληθυσμούς (CD69+, CD25+).
Παρά την έκφραση του PD-1 στο περιφερικό αίμα και τους προσβεβλημένους ιστούς (αρθρικός υμένας) των
ασθενών με ΡΑ, η λειτουργία του ανοσορρυθμιστικού συστήματος PD-1/PD-L1 ενδεχομένως να
τροποποιείται στο φλεγμονώδες περιβάλλον της άρθρωσης. Το ενδεχόμενο αυτό εξετάστηκε κατ’αρχήν, με
καλλιέργειες από SFMCs κύτταρα από ΡΑ και ΟΑ, όπου μελετήθηκε η ικανότητα των κυττάρων αυτών να
επάγουν την έκφραση του PD-1 μετά από ενεργοποίησή τους με PMA και ionomycin. Βρέθηκε ότι στην ΡΑ η
ικανότητα αυτή ήταν μειωμένη (επαγωγή του PD-1 από 18 ± 5% σε 29 ± 4% στην ΡΑ και από 5 ± 2% σε
25 ± 4% στην ΟΑ). Στη συνέχεια, CFSE-σημασμένα CD4+ T λεμφοκύτταρα περιφερικού αίματος,
καλλιεργήθηκαν απουσία ή παρουσία 15% εκχυλίσματος αρθρικού υγρού από ΡΑ. Μετά από ενεργοποίηση
με την πρωτεΐνη PD-L1.Fc, διαπιστώθηκε ότι, παρουσία ορού από ΡΑ, η ικανότητα του PD-1 να αναστέλλει
τον Τ κυτταρικό πολλαπλασιασμό ήταν μειωμένη (αδιαίρετα T κύτταρα την ημέρα 5: 65.1 ± 4.7% vs. 81.2
± 7.8%, p=0.028).
Επιπρόσθετα, για να μελετηθεί η ικανότητα του PD-1 να ρυθμίζει την ενεργοποίηση των Τ κυττάρων που
βρίσκονται στο αρθρικό υγρό της ΡΑ, πραγματοποιήθηκαν κυτταροκαλλιέργειες CD4+ T κυττάρων
περιφερικού αίματος και αρθρικού υγρού από ασθενείς με ΡΑ (paired samples), όπου χορηγήθηκαν διάφορες
συγκεντρώσεις PD-L1.Fc ώστε να ενεργοποιηθεί ο υποδοχέας PD-1. Η ικανότητα του PD-1 να περιορίσει τον
πολ/σμό και την παραγωγή IFN-γ από CD4+ Τ κύτταρα της ρευματοειδούς άρθρωσεηςήταν μειωμένη σε
σχέση με τα κύτταρα του περιφερικού αίματος, ιδιαίτερα σε χαμηλές συγκεντρώσεις PD-L1.Fc (αναστολή
πολ/μού 31 ± 9% vs 53 ± 8% p=0.003).
Β. Μελέτες σε ζώα:
Ποντίκια που δεν εκφράζουν PD-1 (PD-1-/-) δημιουργήθηκαν με διαγραφή του διαμεμβρανικού και
ενδοκυττάριου τμήματος του γονιδίου του PD-1. Η αρθρίτιδα επαγόμενη από κολλαγόνο (collagen-induced
arthritis, CIA) σε ποντικούς αποτελεί ένα κλασσικό και καλά μελετημένο πειραματικό πρότυπο αυτοανοσίας
προσομοιάζον στην ανθρώπινη ρευματοειδή αρθρίτιδα.
Η έλλειψη του PD-1 θα μπορούσε να προκαλέσει υπέρμετρη ενεργοποίηση των Τ κυττάρων και επομένως
αύξηση της έντασης και του ποσοστού της αρθρίτιδας. Για να εξετάσουμε αυτή την υπόθεση, προκλήθηκε
10
CIA σε ποντίκια Β6-PD-1-/- με χορήγηση κολλαγόνου τύπου ΙΙ (CII). Παρατηρήθηκε σημαντικά αυξημένο
ποσοστό και ένταση αρθρίτιδας, που εκτιμήθηκε μακροσκοπικά και ιστολογικά, σε σχέση με τα wild type B6
ποντίκια (mean ± SEM of maximum arthritis score, Β6-PD-1-/- : 5.0 ±1.2, n=16, vs Β6 wt: 2.3 ±1.2, n=14,
p=0.040).
Η ενεργοποίηση του συστήματος PD-1/PD-L1, θα μπορούσε να προκαλέσει την αναστολή της διέγερσης των
Τ λεμφοκυττάρων και επομένως να περιορίσει τον βαθμό της επαγόμενης αρθρίτιδας. Σε Β6 ποντίκια, στο
πειραματικό πρότυπο της CIA, χορηγήθηκε η συνθετική πρωτεΐνη PD-L1.Fc (που αποτελείται από το
εξωκυττάριο τμήμα του PD-L1 και το Fc τμήμα της IgG2a ανοσοσφαιρίνης) που ενεργοποιεί το PD-1 in vivo,
στο στάδιο πρόκλησης της αρθρίτιδας (πρώτες 10 ημέρες). Στα ποντίκια αυτά παρατηρήθηκε ηπιότερη
αρθρίτιδα (μέση ένταση αρθρίτιδας: 1.8 ± 0.6) σε σχέση με τους μάρτυρες, που δεν έλαβαν τη θεραπεία
(2.5 ± 0.7) (n=5 σε κάθε ομάδα).
Συμπερασματικά, τα ευρήματα της μελέτης αυτής υποστηρίζουν ένα σημαντικό ρόλο του ανασταλτικού
συστήματος PD-1/PD-L1 στη ρύθμιση των Τ λεμφοκυττάρων στη ΡΑ. Τεκμηριώνεται διαταραχή της
έκφρασης και λειτουργίας του PD-1 ως συνέπεια του φλεγμονώδους περιβάλλοντος της ΡΑ. Η έκφραση του
PD-1/PD-L1 στον αρθρικό υμένα της ΡΑ και η έντονη επίδρασή του στην ανάπτυξη αρθρίτιδας σε
πειραματικά ζωικά πρότυπα, υποδεικνύουν συμμετοχή του ανοσορρυθμιστικού αυτού συστήματος στην Τ
ανοσολογική ανοχή, με δυνατότητα παρέμβασης για θεραπευτικούς σκοπούς.
|
Αναζήτηση
