| Περίληψη |
Ο καρκίνος του μαστού αποτελεί την πρώτη αιτία νόσησης από καρκίνο στις
γυναίκες, ο οποίος αρκετά συχνά διαγιγνώσκεται σε πρώιμα στάδια και
αντιμετωπίζεται επιτυχώς [1]. Παρόλα αυτά, σε σημαντικό ποσοστό των ασθενών
αναπτύσσονται δευτεροπαθείς μεταστάσεις, οι οποίες αποτελούν την κύρια αιτία
θανάτου των ασθενών με καρκίνο [2]. Ο ακριβής μηχανισμός της διαδικασίας
ανάπτυξης μεταστάσεων δεν έχει έως σήμερα αποσαφηνιστεί πλήρως, γεγονός που
καθιστά επιτακτική την εκτενέστερη μελέτη του.
Πληθώρα δεδομένων που προκύπτουν από μελέτες με καρκινικές σειρές και
μοντέλα ζώων, καθώς και από ασθενείς με καρκίνο, υποδεικνύουν ότι η δημιουργία
μεταστάσεων είναι μία πολυσύνθετη διαδικασία [3]. Τα κύρια στάδια του
μεταστατικού μηχανισμού είναι αρχικά ο πολλαπλασιασμός των καρκινικών
κυττάρων στην πρωτοπαθή εστία, η διείσδυσή τους στο μεσοκυττάριο χώρο που
περιβάλει τον πρωτοπαθή όγκο, η είσοδός τους στη συστηματική κυκλοφορία
(ενδαγγείωση), όπου μετακινούνται είτε ως μεμονωμένα κύτταρα, είτε ως
συσσωματώματα κυττάρων. Ακολουθεί η μετανάστευσή τους σε απομακρυσμένα
σημεία, η έξοδος από την κυκλοφορία (εξαγγείωση) και η διείσδυση σε νέους ιστούς
προκειμένου να σχηματίσουν μικρομεταστάσεις. Τέλος, ο ανεξέλεγκτος
πολλαπλασιασμός τους στα δευτερεύοντα όργανα που έχουν προσβληθεί οδηγεί στην
ανάπτυξη μακροσκοπικά ορατών μεταστάσεων. Οι κυτταρικοί πληθυσμοί που
ανιχνεύονται είτε ως διεσπαρμένα καρκινικά κύτταρα (ΔΚΚ) σε δευτεροπαθείς
εστίες, είτε ως κυκλοφορούντα καρκινικά κύτταρα (ΚΚΚ) στο περιφερικό αίμα των
ασθενών, αποτελούν τα μικρομεταστατικά κύτταρα [4;5].
Όπως προκύπτει από πολλές μελέτες έως σήμερα, η ανίχνευση ΚΚΚ στο αίμα
των ασθενών με καρκίνο μαστού αποτελεί ανεξάρτητο και ισχυρό δείκτη αυξημένης
πιθανότητας υποτροπής και μειωμένης ολικής επιβίωσης, τόσο στην πρώιμη όσο και
τη μεταστατική νόσο [6-8]. Επιπλέον, η παρουσία ΚΚΚ σε ασθενείς με καρκίνο
μαστού έχει συσχετιστεί με μειωμένη ανταπόκριση στα συνήθη χημειοθεραπευτικά
σχήματα [9]. Πέραν όμως της εκτίμησης της παρουσίας των ΚΚΚ, ο μοριακός και
φαινοτυπικός χαρακτηρισμός τους αποτελεί κεντρικό θέμα σημαντικής ερευνητικής
προσπάθειας από πολλές ομάδες, καθώς δεν διαθέτουν όλα τα ΚΚΚ το ίδιο
μεταστατικό δυναμικό [10;11]. Η περαιτέρω μοριακή ανάλυσή τους θα μπορούσε να
10
αναδείξει τα χαρακτηριστικά εκείνα που ευοδώνουν τη μεταστατική διαδικασία,
συμβάλλοντας στην καλύτερη κατανόηση του μηχανισμού της μετάστασης [12].
Επιπλέον, η μελέτη των ΚΚΚ παρέχει τη δυνατότητα του προσδιορισμού του
μοριακού προφίλ του όγκου ανά πάσα χρονική στιγμή και επομένως θεωρείται ως μια
υγρή βιοψία «πραγματικού χρόνου». Η ανίχνευση χαρακτηριστικών που σχετίζονται
με επιθετική κλινική συμπεριφορά ή με αντίσταση στη θεραπεία στα ΚΚΚ είναι
δυνατόν να ταυτοποιήσει υποομάδες ασθενών με φτωχή πρόγνωση [13]. Οι ασθενείς
αυτοί πιθανόν είναι υποψήφιοι για πιο επιθετικές θεραπευτικές προσεγγίσεις ή για
θεραπεία με νέους στοχεύοντες παράγοντες, οι οποίοι θα μπορούσαν να επιλεγούν
ακόμη και με βάση την έκφραση μορίων-στόχων στα ίδια τα ΚΚΚ [14;15]. Για τους
παραπάνω λόγους, τα τελευταία χρόνια αναπτύσσονται ολοένα και περισσότερες
τεχνικές για την ανίχνευση και τον περαιτέρω χαρακτηρισμό των ΚΚΚ στο αίμα των
ασθενών με καρκίνο [16;17].
Μία σημαντική διαδικασία που λαμβάνει χώρα κατά την ανάπτυξη μεταστάσεων
είναι η επιθηλιο-μεσεγχυματική μετάβαση (ΕΜΜ) των καρκινικών κυττάρων,
δηλαδή η σταδιακή μετατροπή του επιθηλιακού τους φαινότυπου σε φαινότυπο
μεσεγχυματικών κυττάρων [18]. Ο μεσεγχυματικός φαινότυπος που αποκτούν τα
καρκινικά κύτταρα διευκολύνει όχι μόνον την αρχική τους διείσδυση μέσω του
πρωτοπαθούς όγκου, αλλά και την ενδαγγείωση και μετακίνησή τους μέσω της
συστηματικής κυκλοφορίας, καθώς επίσης και την εξαγγείωση και τελικά τη
διείσδυσή τους στο νέο όργανο [19]. Παρόλα αυτά, έχει δειχθεί ότι κατά την τελική
φάση του αποικισμού των καρκινικών κυττάρων στο νέο ιστό, ο επιθηλιακός τους
φαινότυπος επανακτάται μέσω της αντίστροφης διαδικασίας της μεσεγχυματο-
επιθηλιακής μετάβασης (ΜΕΜ) [20]. Μία από τις κύριες αλλαγές που παρατηρούνται
κατά την ΕΜΜ αφορά στο πρότυπο έκφρασης των ενδιάμεσων ινιδίων του
κυτταροσκελετού, όπου παρατηρείται γενικά σημαντική μείωση στην έκφραση της
κυτταροκερατίνης, με παράλληλη αύξηση στην έκφραση της βιμεντίνης, η οποία
αποτελεί έναν ισχυρό δείκτη ΕΜΜ και εμφανίζεται απαραίτητη για τη διείσδυση και
ενδαγγείωση των καρκινικών κυττάρων [21;22]. Επιπλέον, σημαντική αλλαγή
παρατηρείται στην έκφραση των μορίων που ενέχονται στις διακυτταρικές επαφές, η
οποία έχει βρεθεί ότι επάγεται μέσω μιας σειράς μεταγραφικών παραγόντων, όπως
είναι οι TWIST, SNAIL και SLUG. Ο μεταγραφικός παράγοντας TWIST αποτελεί
ένα ιδιαίτερα σημαντικό δείκτη ΕΜΜ, ο οποίος ενέχεται σε διάφορα στάδια της
11
μεταστατικής διαδικασίας, όπως η αρχική διείσδυση και η ενδαγγείωση των
καρκινικών κυττάρων [23;24]. Επιπλέον, πολυάριθμες μελέτες έχουν δείξει
συσχέτιση μεταξύ της παρουσίας χαρακτηριστικών συμβατών με ΕΜΜ στον
πρωτοπαθή όγκο των ασθενών με αυξημένη αντίσταση στη χημειοθεραπεία,
αυξημένο κίνδυνο υποτροπής και μειωμένη επιβίωση [25-27].
Όπως υποδεικνύεται από πολλές μελέτες τα τελευταία χρόνια, η ΕΜΜ σχετίζεται
άμεσα με τη γένεση καρκινικών βλαστικών κυττάρων (ΚΒΚ) [28;29]. Τα ΚΒΚ έχουν
ταυτοποιηθεί σε πολλούς τύπους καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του
μαστού, ως ένας μικρός υποπληθυσμός κυττάρων με ιδιότητες χαρακτηριστικές των
βλαστικών κυττάρων. Σύμφωνα με το μοντέλο των ΚΒΚ, τα κύτταρα αυτά
θεωρούνται ως τα μόνα ικανά να «αυτο-ανανεώνονται», να πολλαπλασιάζονται
απεριόριστα και να διαφοροποιούνται, επάγοντας το σχηματισμό όλων των
κυτταρικών υποπληθυσμών που απαρτίζουν τον πρωτοπαθή όγκο [30;31]. Επιπλέον
είναι γνωστό ότι τα ΚΒΚ συμμετέχουν ενεργά στην ανάπτυξη μεταστάσεων, καθώς
ευθύνονται για τη διασπορά του πρωτοπαθούς όγκου, δίνοντας γένεση σε όλους τους
υποπληθυσμούς του [32;33]. Στον καρκίνο του μαστού, ως ΚΒΚ έχουν ταυτοποιηθεί
και απομονωθεί αποτελεσματικά από καρκινικές σειρές και όγκους τα κύτταρα που
φέρουν το φαινοτυπικό προφίλ υψηλής έκφρασης CD44 και απούσας ή χαμηλής
έκφρασης CD24 (CD44high/CD24-/low) [34;35], καθώς επίσης και εκείνα με υψηλή
ενζυμική ενεργότητα της αλδεϋδικής δεϋδρογονάσης (Aldehyde deydrogenase -
ALDH) [36;37]. Η πρωτεϊνική έκφραση του ισοένζυμου ALDH1Α1 έχει επίσης
χρησιμοποιηθεί εκτεταμένα ως δείκτης ΚΒΚ, ωστόσο αντικρουόμενα εμφανίζονται
τα δεδομένα της βιβλιογραφίας σχετικά με την ενεργότητα των 19 συνολικά
διαφορετικών ισοένζυμων της ALDH που εκφράζονται σε καρκινικές σειρές και
επιθηλιακούς όγκους μαστού [37-39]. Επιπλέον, in vitro και in vivo μελέτες
υποστηρίζουν ότι τα ΚΒΚ εμφανίζουν αυξημένη αντίσταση σε ακτινοθεραπεία,
χημειοθεραπεία και ορμονοθεραπεία [40], ενώ η παρουσία τους στον πρωτοπαθή
όγκο ασθενών με καρκίνο μαστού έχει συσχετιστεί με χειρότερη κλινική έκβαση
[36;41].
Σύμφωνα με τα παραπάνω, η ΕΜΜ και η προτεινόμενη θεωρία των ΚΒΚ
πιστεύεται ότι κατέχουν σημαντική θέση στην βιολογία των ΚΚΚ. Η παρουσία
δεικτών ΚΒΚ ή ΕΜΜ στα ΚΚΚ πιθανόν ταυτοποιεί έναν κυτταρικό υποπληθυσμό με
αυξημένη ανθεκτικότητα στη χημειοθεραπεία και ενισχυμένη ικανότητα να
12
δημιουργεί μεταστάσεις. Στα πλαίσια αυτά, το 2010 η ομάδα μας έδειξε ότι τα ΚΚΚ
των ασθενών με μεταστατικό καρκίνο μαστού εκφράζουν πράγματι σημαντικούς
δείκτες ΚΒΚ, όπως είναι το προφίλ CD44high/CD24-/low και η υψηλή έκφραση της
ALDH1, σε επίπεδο μονήρων ΚΚΚ [42]. Επιπλέον, σε μελέτη της ομάδας μας το
2011, διαπιστώθηκε ότι τα ΚΚΚ ασθενών με πρώιμο και μεταστατικό καρκίνο
μαστού είναι δυνατόν να βρίσκονται σε μία ενδιάμεση κατάσταση ΕΜΜ,
εκφράζοντας παράλληλα επιθηλιακούς και μεσεγχυματικούς δείκτες, όπως είναι η
βιμεντίνη και ο μεταγραφικός παράγοντας TWIST. Στη μελέτη αυτή βρέθηκε
επιπλέον ότι η συχνότητα των ΚΚΚ με φαινότυπο ενδιάμεσης ΕΜΜ ήταν σημαντικά
αυξημένη στο μεταστατικό παρά το πρώιμο στάδιο, υποδεικνύοντας την επιλογή τους
κατά τη μεταστατική εξέλιξη της νόσου [43]. Όλο και περισσότερες μελέτες τα
τελευταία χρόνια διερευνούν με διάφορες μεθοδολογίες την παρουσία δεικτών για
ΕΜΜ και ΚΒΚ στα ΚΚΚ ασθενών με καρκίνο μαστού [44;45], εντούτοις δεν
υπάρχουν κλινικές μελέτες που να περιγράφουν το φαινόμενο σε καλά καθορισμένες
ομάδες με μεγάλους αριθμούς ασθενών. Επιπλέον, δεν έχει δειχθεί έως σήμερα η
σύγχρονη έκφραση δεικτών ΚΒΚ και ΕΜΜ στα ΚΚΚ σε επίπεδο μονήρων
κυττάρων. Με βάση τα παραπάνω, σχεδιάστηκε η παρούσα μελέτη για τη διερεύνηση
της παρουσίας ΚΚΚ που φέρουν παράλληλα φαινότυπους ΚΒΚ και ενδιάμεσης
ΕΜΜ σε ασθενείς με καρκίνο μαστού. Στόχος ήταν η διερεύνηση της συχνότητάς
τους σε ασθενείς με πρώιμη και μεταστατική νόσο, η εκτίμηση της πιθανής
αντίστασής τους στη χημειοθεραπεία, καθώς επίσης της προγνωστικής τους αξίας.
Για το σκοπό αυτό, αναπτύχθηκε μία νέα μεθοδολογία τριπλού ανοσοφθορισμού
σε απομονωμένα μονοπύρηνα κύτταρα του περιφερικού αίματος των ασθενών, μέσω
της οποίας ελέγχθηκε η έκφραση των κυτταροκερατινών 8, 18 και 19 για τον
εντοπισμό των ΚΚΚ, ενώ ως δείκτες ΚΒΚ και ΕΜΜ χρησιμοποιήθηκαν αντίστοιχα η
ALDH1 και το TWIST. Η συνέκφραση των παραπάνω μορίων αξιολογήθηκε σε
επίπεδο μονήρων κυττάρων μέσω του ημι-αυτοματοποιημένου συστήματος
μικροσκοπίας φθορισμού ARIOL. Κατά την ανάπτυξη της μεθόδου, διερευνήθηκαν
αρχικά τα διαφορετικά πρότυπα έκφρασης της ALDH1 και του TWIST σε
κατάλληλες σειρές ελέγχου και σε τρεις καρκινικές σειρές μαστού, SKBR3, MCF7
και MDA.MB.231, οι οποίες είναι αντιπροσωπευτικές των κύριων μοριακών
υπότυπων του καρκίνου του μαστού, HER2-θετικού, ορμονο-θετικού και τριπλά-
αρνητικού, αντιστοίχως. Ειδικότερα, η έκφρασης της ALDH1 χαρακτηρίστηκε ως
13
υψηλή (ALDH1high) και χαμηλή ή απούσα (ALDH1low/neg), έπειτα από
ποσοτικοποίηση των επιπέδων έκφρασης της πρωτεΐνης μέσω του συστήματος
ARIOL, ενώ η έκφραση του TWIST χαρακτηρίστηκε βάσει της υποκυττάριας
εντόπισής του σε πυρηνική (TWISTnuc) και κυτταροπλασματική ή απούσα
(TWISTcyt/neg). Σύμφωνα με τα δεδομένα της υπάρχουσας βιβλιογραφίας, ως
φαινότυπος ΚΒΚ και ΕΜΜ ορίστηκε η υψηλή έκφραση της ALDH1 και η πυρηνική
εντόπιση του TWIST, αντιστοίχως [38;46]. Επιπλέον, μέσω μίας σειράς πειραμάτων
ελέγχου με τη χρήση των παραπάνω καρκινικών σειρών, καθώς επίσης και δείγματος
φυσιολογικών αιμοδοτών, επιβεβαιώθηκε η υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα της
μεθόδου ανίχνευσης των δύο δεικτών στα ΚΚΚ.
Ακολούθως, η παραπάνω μεθοδολογία εφαρμόστηκε στα ΚΚΚ 80 ασθενών με
πρώιμο και 50 με μεταστατικό καρκίνο μαστού. Όπως διαπιστώθηκε, οι δύο δείκτες
ανιχνεύτηκαν στα ΚΚΚ στο σύνολο σχεδόν των ασθενών που μελετήθηκαν, ωστόσο
το προφίλ της έκφρασής τους διέφερε μεταξύ των δύο κλινικών σταδίων. Η
συχνότητα των ΚΚΚ με φαινότυπο ΚΒΚ (ALDH1high) ήταν σημαντικά αυξημένη στη
μεταστατική νόσο, σε αντίθεση με την πρώιμη, όπου ανιχνεύτηκαν κυρίως ΚΚΚ μη-
βλαστικού φαινότυπου (ALDH1low/neg). Επιπλέον, η παρουσία των ΚΚΚ με
φαινότυπο ενδιάμεσης ΕΜΜ (TWISTnuc) ήταν σημαντικά συχνότερη στο
μεταστατικό στάδιο, ενώ αντιθέτως στο πρώιμο ανιχνεύθηκαν συχνότερα ΚΚΚ
επιθηλιακού φαινότυπου (TWISTcyt/neg). Αξιολογώντας στη συνέχεια τη συνέκφραση
των δύο μορίων σε επίπεδο κυττάρου, διαπιστώθηκε ότι η πλειοψηφία των ασθενών
με μεταστατική νόσο είχε ανιχνεύσιμα ΚΚΚ που έφεραν παράλληλα τους δύο
φαινότυπους (ALDH1high/TWISTnuc), σε αντίθεση με τους ασθενείς πρώιμου σταδίου,
οι οποίοι εμφάνισαν κυρίως ΚΚΚ μη-βλαστικού επιθηλιακού φαινότυπου
(ALDH1low/neg/TWISTcyt/neg). Η συσχέτιση μεταξύ των δύο φαινότυπων στα ΚΚΚ των
ασθενών με μεταστατικό καρκίνο επιβεβαιώθηκε περαιτέρω και στατιστικά. Η
παρούσα μελέτη προσέφερε μία νέα, ευαίσθητη και ειδική μεθοδολογία για το
χαρακτηρισμό των ΚΚΚ ως προς τη συνέκφραση δύο πολύ σημαντικών δεικτών
ΚΒΚ και ΕΜΜ. Η διαπίστωση ότι σε κάθε εξελικτικό στάδιο του καρκίνου μαστού
παρατηρήθηκε διαφορετικό πρότυπο έκφρασης των δύο δεικτών, αφενός αναδεικνύει
τη σημασία της φαινοτυπικής ανάλυσης των ΚΚΚ, αφετέρου αντικατοπτρίζει τη
δυναμική της εξέλιξης των χαρακτηριστικών ΚΒΚ και ΕΜΜ. Το γεγονός ότι η
συχνότητα των ΚΚΚ με σύγχρονη έκφραση των φαινότυπων ΚΒΚ και ενδιάμεσης
14
ΕΜΜ ήταν σημαντικά αυξημένη στη μεταστατική νόσο υποδεικνύει επίσης ότι ο
συγκεκριμένος υποπληθυσμός ΚΚΚ επιλέγεται κατά την εξέλιξη της νόσου λόγω της
συμμετοχής τους στη μεταστατική διαδικασία. Τέλος, διαπιστώθηκε για πρώτη φορά
η συνέκφραση δύο σημαντικών δεικτών ΚΒΚ και ΕΜΜ σε επίπεδο μονήρων ΚΚΚ,
ενισχύοντας ακόμη περισσότερο τη συσχέτιση μεταξύ τους, ενώ για πρώτη φορά
δείχθηκε ότι οι δύο φαινότυποι μεταβάλλονται παράλληλα στα ΚΚΚ κατά τη
μεταστατική εξέλιξη του καρκίνου του μαστού.
Στη συνέχεια, διερευνήθηκε η επίδραση της χημειοθεραπείας στη συχνότητα
ανίχνευσης των ΚΚΚ με φαινότυπους ΚΒΚ και ενδιάμεσης ΕΜΜ. Για το σκοπό
αυτό, η παραπάνω μεθοδολογία εφαρμόσθηκε σε μία μεγαλύτερη και καλά
καθορισμένη ομάδα 154 ασθενών με μεταστατικό καρκίνο μαστού πριν την έναρξη
της πρώτης γραμμής χημειοθεραπείας. Στους ασθενείς με ανιχνεύσιμα ΚΚΚ πριν τη
θεραπεία, ελέγχθηκε επιπλέον δείγμα αμέσως μετά την ολοκλήρωση της θεραπείας.
Τα ΚΚΚ που ανιχνεύθηκαν πριν τη θεραπεία στην πλειοψηφία τους έφεραν τους
φαινότυπους ΚΒΚ και ενδιάμεσης ΕΜΜ, παρατήρηση η οποία επιβεβαιώθηκε στη
συνέχεια και μετά τη θεραπεία. Παρόλο που στην πλειοψηφία των ασθενών η
θεραπεία οδήγησε σε μείωση ή πλήρη εξάλειψη των συνολικών ΚΚΚ, εντούτοις είχε
επίσης ως αποτέλεσμα τον εμπλουτισμό των ΚΚΚ με χαρακτήρες ΚΒΚ και
ενδιάμεσης ΕΜΜ, ενώ ακόμη μεγαλύτερη και στατιστικά σημαντική ήταν η αύξηση
των ΚΚΚ που έφεραν παράλληλα τους δύο φαινότυπους. Τα παραπάνω ευρήματα
προσφέρουν σημαντικές ενδείξεις ότι τα ΚΚΚ με χαρακτηριστικά ΚΒΚ και
ενδιάμεσης ΕΜΜ εμφανίζουν αυξημένη χημειο-αντίσταση, με αποτέλεσμα να
επιλέγονται έπειτα από τη χορήγηση χημειοθεραπείας. Η παρούσα μελέτη έδειξε για
πρώτη φορά ότι η ανθεκτικότητα των ΚΚΚ στα συνήθη χημειοθεραπευτικά σχήματα
ενισχύεται σημαντικά από τη σύγχρονη παρουσία των χαρακτηριστικών ΚΒΚ και
ενδιάμεσης ΕΜΜ, αναδεικνύοντας περαιτέρω τη συμμετοχή του συγκεκριμένου
υποπληθυσμού ΚΚΚ στη μεταστατική διαδικασία.
Τα ευρήματα της παρούσας μελέτης έδειξαν επίσης για πρώτη φορά την
προγνωστική σημασία της ανίχνευσης ΚΚΚ μέσω της μικροσκοπίας ARIOL.
Ειδικότερα, διαπιστώθηκε ότι ο αριθμός των συνολικών ΚΚΚ, τόσο πριν, όσο και
μετά τη χημειοθεραπεία, συσχετίστηκε με πρόοδο νόσου στο τέλος της
χημειοθεραπείας, ενώ η παρουσία τους πριν τη χημειοθεραπεία συσχετίστηκε επίσης
με συνολική επιβίωση των ασθενών μικρότερη της διετίας. Επιπλέον, η παρουσία
15
ΚΚΚ με χαρακτήρα ΚΒΚ και ενδιάμεσης ΕΜΜ συσχετίστηκε με την παρουσία
μεταστάσεων σε συγκεκριμένα όργανα, όπως τα οστά και τους πνεύμονες, ωστόσο,
αντικρουόμενα δεδομένα προέκυψαν όσον αφορά στην προγνωστική τους αξία ως
προς την ανταπόκριση στη χημειοθεραπεία και την επιβίωση. Παρόλο που η
χημειοθεραπεία οδήγησε σε σημαντική αύξηση των ΚΚΚ με χαρακτήρες ΚΒΚ και
ενδιάμεσης ΕΜΜ αποκλειστικά στους ασθενείς που έκαναν πρόοδο νόσου και όχι σε
εκείνους που ανταποκρίθηκαν στη χημειοθεραπεία, εντούτοις η παρουσία των
συγκεκριμένων κυτταρικών υποπληθυσμών συσχετίστηκε με καλύτερη ανταπόκριση
στη χημειοθεραπεία και αυξημένη επιβίωση έως την υποτροπή. Η παραπάνω
παρατήρηση ενδεχομένως οφείλεται σε στατιστικό λάθος, καθώς στην παρούσα
ανάλυση εντάχθηκαν αποκλειστικά οι ασθενείς με ανιχνεύσιμα ΚΚΚ πριν τη
χημειοθεραπεία, οι οποίοι πιθανότατα συνιστούν μία ομάδα ασθενών κακής
πρόγνωσης. Η αξιολόγηση όλων των ασθενών μετά την ολοκλήρωση της
χημειοθεραπείας και η εκτίμηση της κλινικής τους πορείας αναμένεται να
συμβάλλουν στην αποσαφήνιση της προγνωστικής σημασίας της ανίχνευσης ΚΚΚ με
φαινότυπους ΚΒΚ και ενδιάμεσης ΕΜΜ.
Στη συνέχεια, διερευνήθηκε εάν τα ΚΚΚ που εμφανίζουν το φαινότυπο ΚΒΚ
όπως ορίστηκε βάσει της υψηλής έκφρασης του ισοένζυμου ALDH1Α1, φέρουν και
λειτουργικά χαρακτηριστικά των ΚΒΚ. Ως δείκτης λειτουργικότητας ΚΒΚ
χρησιμοποιήθηκε η ενζυμική ενεργότητα της ALDH, ο έλεγχος της οποίας
πραγματοποιήθηκε μέσω κατάλληλης μεθοδολογίας, γνωστής ως δοκιμή
ALDEFLUOR με τη χρήση κυτταρομετρίας ροής [47]. Η συσχέτιση μεταξύ της
ενζυμικής ενεργότητας ALDH και της υψηλής πρωτεϊνικής έκφρασης ALDH1
διερευνήθηκε αρχικά μέσω μίας σειράς πειραμάτων ανοσοφθορισμού,
ανοσοαποτύπωσης και δοκιμής ALDEFLUOR στη σειρά ελέγχου HepG και τις τρεις
αντιπροσωπευτικές σειρές μαστού SKBR3, MCF7 και MDA.MB.231. Θετική
συσχέτιση μεταξύ ενεργότητας και έκφρασης διαπιστώθηκε στα κύτταρα ελέγχου
HepG2, σε αντίθεση με τις σειρές μαστού, όπου το ποσοστό των κυττάρων με υψηλή
έκφραση ALDH1 ήταν μεγαλύτερο από ότι εκείνων με υψηλή ενεργότητα ALDH,
υποδεικνύοντας ότι το ισοένζυμο ALDH1Α1 που εκφράζεται στα καρκινικά κύτταρα
μαστού δεν είναι πάντοτε ενζυμικά ενεργό. Τα παραπάνω ευρήματα υποδεικνύουν ότι
η μεθοδολογία που αναπτύχθηκε μέσω του συστήματος ARIOL επιτρέπει την
ταυτοποίηση του κυτταρικού πληθυσμού που εκφράζει την ενζυμικά ενεργή πρωτεΐνη
16
ALDH1, ωστόσο παράλληλα ανιχνεύει και τα κύτταρα στα οποία η πρωτεΐνη είναι
ανενεργή. Tα δεδομένα που προέκυψαν από τα κύτταρα ελέγχου HepG2
επιβεβαιώνουν ότι δεν πραγματοποιείται απώλεια του ενζυμικά ενεργού κυτταρικού
πληθυσμού. Εν συνεχεία, διερευνήθηκε η πιθανή συσχέτιση της υψηλής έκφρασης
ALDH1 με την ενεργότητα ALDH στα ΚΚΚ ασθενών με μεταστατικό καρκίνο
μαστού. Η μέθοδος ανίχνευσης της ενεργότητας ALDH στα ΚΚΚ αναπτύχθηκε μέσω
μίας σειράς πειραμάτων σε διαδοχικές αραιώσεις των καρκινικών κυττάρων της κάθε
σειράς σε απομονωμένα μονοπύρηνα κύτταρα αίματος φυσιολογικών αιμοδοτών
(αραιώσεις των 10, 100, 1.000 και 10.000 κυττάρων ανά 106 αιμοποιητικών
κυττάρων). Η ταυτοποίηση των καρκινικών κυττάρων πραγματοποιήθηκε μέσω της
ανίχνευσης της έκφρασης των μορίων της επιφάνειας EpCAM και CD45, έναντι της
κυτταροκερατίνης, καθώς η δοκιμή ALDEFLUOR δεν επιτρέπει τη σύγχρονη
ταυτοποίηση ενδοκυττάριων μορίων. Σε συμφωνία με άλλες μελέτες ανίχνευσης
ΚΚΚ μέσω κυτταρομετρίας ροής, η παρούσα μελέτη έδειξε ότι η μέθοδος εμφανίζει
υψηλή ευαισθησία, ωστόσο στις μεγάλες αραιώσεις των 10 και 100 καρκινικών
κυττάρων παρατηρήθηκε υπερεκτίμηση του αριθμού των καρκινικών κυττάρων.
Επιπλέον, η ανίχνευση της ενεργότητας της ALDH πραγματοποιήθηκε με μεγάλη
ευαισθησία στο σύνολο των αραιώσεων, ωστόσο και εδώ η παρατηρήθηκε μείωση
της ποσοστιαίας ενεργότητας με την αυξανόμενη αραίωση των καρκινικών κυττάρων,
υποδεικνύοντας ότι η μεθοδολογία που αναπτύχθηκε ενδείκνυται για ασθενείς με
υψηλό φορτίο ΚΚΚ.
Ακολούθως, επιλέχθηκε ένα μικρό δείγμα εννέα ασθενών με μεταστατική νόσο
και πολλαπλές μεταστάσεις, οι οποίοι είχαν λάβει τουλάχιστον δύο γραμμές
χημειοθεραπείας. Στους ασθενείς αυτούς πραγματοποιήθηκε παράλληλα έλεγχος της
υψηλής ενεργότητας ALDH και της υψηλής έκφρασης ALDH1 στα ΚΚΚ, μέσω
κυτταρομετρίας ροής και της μικροσκοπίας ARIOL, αντίστοιχα. Όπως διαπιστώθηκε,
στατιστικά σημαντική ήταν η συσχέτιση τόσο του αριθμού των ΚΚΚ που
ανιχνεύτηκαν με τις δύο μεθόδους, όσο και μεταξύ του αριθμού των ΚΚΚ με υψηλή
ALDH ενεργότητα και υψηλή ALDH1 έκφραση. Επομένως, η παρούσα μελέτη έδειξε
για πρώτη φορά ότι η έκφραση της ALDH1 στα ΚΚΚ των ασθενών με μεταστατικό
καρκίνο μαστού σχετίζεται θετικά με την ενεργότητα του ενζύμου, επιβεβαιώνοντας
ότι η μεθοδολογία που αναπτύχθηκε μέσω του ARIOL ταυτοποιεί τον πληθυσμό των
ΚΚΚ που εμφανίζει δραστικότητα ΚΒΚ. Τέλος, μέσω της κυτταρομετρίας ροής ήταν
17
δυνατή η εκτίμηση της ενεργότητας της ALDH στο σύνολο CD45-αρνητικών
κυττάρων ανεξάρτητα από την έκφραση του EpCAM, στα οποία συμπεριλαμβάνεται
μεταξύ άλλων ο υποπληθυσμός των ΚΚΚ με πλήρη απώλεια έκφρασης επιθηλιακών
δεικτών στα πλαίσια της ολοκληρωμένης ΕΜΜ. Όπως διαπιστώθηκε, η ενεργότητα
της ALDH στο συγκεκριμένο πληθυσμό κυττάρων ήταν αυξημένη συγκριτικά με τον
πληθυσμό των EpCAM-θετικών/CD45-αρνητικών κυττάρων, υποδεικνύοντας ότι η
παραπάνω προσέγγιση επιτρέπει την ανίχνευση του πληθυσμού των ΚΚΚ με πλήρη
ΕΜΜ και παράλληλα λειτουργικό χαρακτήρα ΚΒΚ.
Συνοψίζοντας, στα πλαίσια της παρούσας διατριβής πραγματοποιήθηκε μία
φαινοτυπική ανάλυση των ΚΚΚ ασθενών με καρκίνο μαστού, ως προς την παρουσία
χαρακτηριστικών ΚΒΚ και ενδιάμεσης ΕΜΜ. Η παρούσα μελέτη προσέφερε μία νέα
μεθοδολογία για την ευαίσθητη και ειδική ανίχνευση της συνέκφρασης δύο
σημαντικών δεικτών ΚΒΚ και ΕΜΜ στα ΚΚΚ σε επίπεδο κυττάρου. Όπως
διαπιστώθηκε, το προφίλ της έκφρασης των δύο δεικτών στα ΚΚΚ ήταν
διαφοροποιημένο μεταξύ της πρώιμης και μεταστατικής νόσου, αναδεικνύοντας τη
δυναμική της εξέλιξης των παραπάνω χαρακτηριστικών σε επίπεδο ΚΚΚ. Η
διαπίστωση ότι η συχνότητα των ΚΚΚ με χαρακτήρα ΚΒΚ και ενδιάμεσης ΕΜΜ
ήταν σαφώς αυξημένη στη μεταστατική νόσο, πρόσφερε σημαντικές ενδείξεις για τη
συμμετοχή τους στη μεταστατική διαδικασία. Επίσης περιγράφηκε για πρώτη φορά η
σύγχρονη έκφραση δεικτών ΚΒΚ και ΕΜΜ στο ίδιο κύτταρο, επιβεβαιώνοντας τη
συσχέτιση μεταξύ των δύο χαρακτηριστικών στα ΚΚΚ. Επιπλέον, βρέθηκε ότι τα
ΚΚΚ που έφεραν παράλληλα τους φαινότυπους ΚΒΚ και ενδιάμεσης ΕΜΜ είχαν
αυξημένη ανθεκτικότητα στα συνήθη χημειοθεραπευτικά φάρμακα και ότι η έλλειψη
ανταπόκρισης στη χημειοθεραπεία συσχετίστηκε με τον εμπλουτισμό του
συγκεκριμένου υποπληθυσμού ΚΚΚ. Η παρουσία των παραπάνω πληθυσμών ΚΚΚ
συσχετίστηκε επίσης με την παρουσία μεταστάσεων σε συγκεκριμένα όργανα, ενώ η
προγνωστική αξία της ανίχνευσής τους ως προς την επιβίωση των ασθενών μένει να
διερευνηθεί περαιτέρω. Τέλος, αξιολογήθηκε μέσω κατάλληλης λειτουργικής δοκιμής
η δραστικότητα του χαρακτήρα ΚΒΚ των ΚΚΚ ασθενών με μεταστατικό καρκίνο
μαστού, επιβεβαιώνοντας ότι η μεθοδολογία που αναπτύχθηκε μέσω του ARIOL
ταυτοποιεί έναν ενεργό υποπληθυσμό ΚΚΚ με λειτουργικά χαρακτηριστικά ΚΒΚ.
Επομένως, όπως υποδεικνύεται από τα παραπάνω, τα ΚΚΚ με χαρακτηριστικά
βλαστικών κυττάρων και ενδιάμεσης ΕΜΜ πιθανά συμμετέχουν στη μεταστατική
18
εξέλιξη του καρκίνου του μαστού και επιπλέον εμφανίζουν αντίσταση στα συνήθη
χημειοθεραπευτικά σχήματα. Με την παρούσα μελέτη αναδεικνύεται αφενός η
σημασία της εκτενούς φαινοτυπικής μελέτης των ΚΚΚ για την αποσαφήνιση του
ρόλου τους στη μεταστατική διαδικασία και αφετέρου η ανάγκη εύρεσης
εναλλακτικών θεραπειών που θα στοχεύουν σε μόρια που σχετίζονται άμεσα με τα
χαρακτηριστικά ΚΒΚ και ΕΜΜ. Μια τέτοια προσέγγιση θα μπορούσε να συμβάλλει
σημαντικά στην αποτελεσματικότερη αντιμετώπιση των ασθενών με καρκίνο μαστού.
|
Αναζήτηση
