E-Locus - Ιδρυματικό Καταθετήριο Πανεπιστημίου Κρήτης

Αρχική Αναζήτηση

Αποτελέσματα - Λεπτομέρειες

Εντολή Αναζήτησης : Συγγραφέας="Κοκκινίδης" Και Συγγραφέας="Μιχάλης"

Τρέχουσα Εγγραφή: 9 από 12

[Προσθήκη στο καλάθι]

Κωδικός Πόρου

000403634

Τίτλος

Μελέτες δραστικότητας ενός τεχνητού περιοριστικού ενζύμου με νέα ειδικότητα

Άλλος τίτλος

Activity studies of an artificial restriction enzyme with new specificity

Συγγραφέας

Λεμονάκης, Άγγελος Α.

Σύμβουλος διατριβής

Κοκκινίδης, Μιχάλης

Μέλος κριτικής επιτροπής

Αθανασάκη, Ειρήνη
Πετράτος, Κυριάκος

Περίληψη

Τα περιοριστικά ένζυμα τύπου ΙΙ αποτελούν τα σύγχρονα «ψαλίδια» της μοριακής βιολογίας με ποικίλες εφαρμογές στη βιοϊατρική έρευνα, τη βιοτεχνολογία και τη διάγνωση. Εκτενείς μελέτες μετά τα μέσα του προηγούμενου αιώνα έχουν εστιάσει στη βιολογική τους δράση στα βακτηριακά κύτταρα, ενώ η επανάσταση της τεχνολογίας ανασυνδυασμένου DNA αποτέλεσε τα μέσο για περαιτέρω έρευνα στις σχέσεις δομής-λειτουργίας αυτών των ενζύμων. Μεταξύ αυτών, το περιοριστικό ένζυμο EcoRV είναι μια από τις πιο καλά μελετημένες πρωτεΐνες, ενώ ενδιαφέρον παρουσιάζει μια από τις πιο μικρές ενδονουκλεάσες περιορισμού τύπου ΙΙ, η PvuII. Tα δυο αυτά ένζυμα, μολονότι στερούνται ιδιαίτερης ομολογίας στην πρωτοταγή τους αλληλουχία, παρουσιάζουν αξιοσημείωτη δομική ομοιότητα. Το γεγονός αυτό αποτέλεσε τον κινητήριο μοχλό για τη δημιουργία μιας τεχνητής πρωτεΐνης σύντηξης, σχεδιασμένης να επιτελεί μια καινούργια εξειδικευμένη αντίδραση ενδονουκλεολυτικής πέψης, στα πλαίσια της γενικότερης προσέγγισης για ανακάλυψη καινοτομικών ενζύμων. Πρόκειται για την πρωτεΐνη μονής αλυσίδας (single chain) EcoRV-PvuII, η οποία ενσωματώνει τις γενετικά τροποποιημένες πρωτεϊνικές επικράτειες των δυο εν λόγω ενζύμων. Η πρωτεΐνη EcoRV-PvuII σχεδιάστηκε στο εργαστήριο Κρυσταλλογραφίας του κ. Κοκκινίδη και η υλοποίηση της παραγωγής και της μελέτης της αποτέλεσε αντικείμενο της παρούσας διατριβής. Αρχικός στόχος ήταν η έκφρασή της σε διαλυτή μορφή, μιας και έτσι εκδηλώνουν τα περιοριστικά ένζυμα τη βιολογική τους δράση. Εν συνεχεία έγιναν προσπάθειες απομόνωσης της πρωτεΐνης, με απώτερο στόχο την αξιοποίηση της σε δοκιμές πέψης με υπόστρωμα πλασμιδιακό DNA, καθώς και τον εν δυνάμει δομικό χαρακτηρισμό της. Μέσω της Χρωματογραφίας Συγγένειας και τη χρήση κολώνας Νi-NTA αγαρόζης, η πρωτεΐνη απομονώθηκε αποτελεσματικά σε συγκέντρωση 300 mM Ιμιδαζολίου υπό την παρουσία αποδιατακτικών παραγόντων, λόγω της εμφάνισης πρωτεϊνικών συσσωματωμάτων (inclusion bodies). Ωστόσο, εξαιτίας μη ειδικής δραστικότητας που παρατηρήθηκε στις δοκιμές πέψης με DNA, πραγματοποιήθηκε μερικός καθαρισμός σε μη αποδιατακτικούς παράγοντες. Προς έκπληξή μας, μέσω ηλεκτροφορητικής ανάλυσης, διαπιστώθηκε εμφανής βελτίωση στην εξειδίκευση της EcoRV-PvuII, που ομοιάζει σε μεγάλο βαθμό στην ειδικότητα της περιοριστικής ενδονουκλεάσης PvuII. Το αποτέλεσμα αυτό αποτελεί σημαντική παρακαταθήκη για μελλοντική μελέτη της πρωτεΐνης, που ενδεχομένως να απομονωθεί πιο αποτελεσματικά υπό μη αποδιατακτικές συνθήκες και να χρησιμοποιηθεί σε πειράματα Κρυσταλλογραφικής ανάλυσης με ακτίνες Χ. Παράλληλα, εκκρεμούν δοκιμές πέψης με ολιγονουκλεοτιδικό υπόστρωμα DNA, που πιθανώς να πιστώσουν περισσότερο τον εξειδικευμένο χαρακτήρα της ΕcoRV-PvuII.

Φυσική περιγραφή

61 φύλλα : πίν., σχήμ., εικ. (μερ. έγχρ.) ; 30 εκ.

Γλώσσα

Ελληνικά

Θέμα

EcoRV

Pvull

Restriction endonuclease

Ενδονουκλεάση περιορισμού

Ημερομηνία έκδοσης

2016-11-18

Συλλογή