| Περίληψη |
ΕΙΣΑΓΩΓΗ
Η ενδομήτρια υπολειπόμενη ανάπτυξη (ΕΥΑ) (intrauterine growth restriction IUGR) περιγράφει μία κατάσταση κατά την οποία το έμβρυο δεν μπορεί να αναπτυχθεί όσο του υπαγορεύει η γενετική του προδιάθεση. Τα νεογνά που γεννιούνται με ΕΥΑ είναι μικρότερα για τη δεδομένη ηλικία κύησης (μικρά για την ηλικία κύησης, small for gestational age SGA), και το βάρος τους είναι κάτω από την 10η ή 5η ή 3η εκατοστιαία θέση για την ηλικία κύησης, σύμφωνα με διαφορετικούς ορισμούς. Είναι πολύ σημαντικό να είμαστε σε θέση να διαγνώσουμε τα νεογνά που είναι μικρά για την ηλικία κύησης επειδή είχαν υπολειπόμενη ανάπτυξη κατά τη διάρκεια της ενδομήτριας ζωής τους, σε σχέση με αυτά που είναι «προγραμματισμένα» για να γεννηθούν μικρά. Τα νεογνά της πρώτης κατηγορίας, εμφανίζουν βραχυπρόθεσμες και μακροπρόθεσμες επιπτώσεις στην ανάπτυξη και υγεία τους γιατί ουσιαστικά κάποιος βλαπτικός παράγοντας επέδρασε στην ομαλή αύξηση τους κατά τη διάρκεια της εμβρυϊκής ζωής τους με αποτέλεσμα να μην αναπτυχθούν όσο θα μπορούσαν με βάση τη γενετική τους προδιάθεση.
Οι αιτιολογικοί παράγοντες που έχουν συσχετιστεί με την παθοφυσιολογία της ΕΥΑ έχουν παραδοσιακά χωριστεί σε 3 κατηγορίες: μητρικοί, εμβρυικοί και μητροπλακουντιακοί παράγοντες. Η πλακουντιακή ανεπάρκεια όμως αφορά την πλειοψηφία των περιπτώσεων ΕΥΑ. Η συνεχιζόμενη έρευνα για την ανεύρεση των παθογενετικών μηχανισμών της ΕΥΑ έχει συσχετίσει διαφορετικά γενετικά αίτια με την εμφάνιση της παθολογικής αυτής οντότητας. Παρόλα αυτά δεν έχει βρεθεί κάποιος παράγοντας ο οποίος μπορεί να προβλέψει την εμφάνιση ΕΥΑ από τα αρχικά στάδια της κύησης, ή να μπορεί να εξηγήσει την 10
παθοφυσιολογία της νόσου. Οι έρευνες σε μοριακό επίπεδο θα μπορούσαν να βοηθήσουν στη διαλεύκανση των διεργασιών που αφορούν την ΕΥΑ, η οποία είναι ξεκάθαρο πλέον ότι δεν αποτελεί μία μεμονωμένη νόσο, αλλά ένα σύμπτωμα πολλών διαφορετικών επιπλοκών της κύησης.
Τα γονίδια αποτύπωσης αποτελούν μία κατηγορία γονιδίων που σχετίζονται με την αύξηση και τη λειτουργία του πλακούντα, και κατά συνέπεια αποτελούν ιδανικούς υποψηφίους για τη μελέτη γενετικών μηχανισμών που σχετίζονται με διαταραχές στην πλακουντιακή λειτουργία που συνεπάγονται καθυστέρηση της ανάπτυξης του εμβρύου. Η αποτύπωση αποτελεί ένα μοριακό μηχανισμό κατά τον οποίο μόνο το ένα αλληλόμορφο από ένα ζεύγος γονιδίων εκφράζεται, και εξαρτάται από την προέλευση του χρωμοσώματος του (μητρική ή πατρική) το κατά πόσο θα εκφραστεί ή όχι. Αυτή η ελεγχόμενη έκφραση, ρυθμίζεται από επιγενετικούς μηχανισμούς όπως η μεθυλίωση του DNA. Η μεθυλίωση της κυτοσίνης μπλοκάρει τον μηχανισμό μεταγραφής ενός γονιδίου. Η μεθυλίωση στους εκκινητές των γονιδίων έχει σαν αποτέλεσμα την μη αναγνώριση τους από τους παράγοντες μεταγραφής και την RNA πολυμεράση, αφού οι μεθυλιωμένες κυτοσίνες προτιμούν να συνδέονται με μία πρωτείνη η οποία ονομάζεται μεθυλ- κυτοσίνη συνδετική πρωτείνη ή MeCP. Όταν η περιοχή ενός εκκινητή αναγνωριστεί από έναν παράγοντα μεταγραφής ως μεθυλιωμένη, τότε η μεταγραφή θα ανασταλεί.
Πολλά γονίδια αποτύπωσης εκφράζονται σε σημαντικό βαθμό στον πλακούντα και επηρεάζουν τη λειτουργία και τη μορφολογία του. Τα πατρικής προέλευσης εκφραζόμενα γονίδια ευνοούν την ανάπτυξη του εμβρύου, ενώ αντίθετα τα μητρικής προέλευσης εκφραζόμενα γονίδια «φρενάρουν» την ανεξέλεγκτη παροχή συστατικών προς το έμβρυο με στόχο την εξοικονόμηση πόρων προς όφελος της μητέρας και των επόμενων κυήσεων.
11
Τα γονίδια IGF2 και Η19 αποτελούν δύο γονίδια αποτύπωσης που μοιράζονται κοινούς μεταγραφικούς μηχανισμούς αλλά με αντίθετο τρόπο και παίζουν σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του εμβρύου. Το γονίδιο IGF2 εκφράζεται από το πατρικό αλληλόμορφο και ευνοεί την ανάπτυξη του εμβρύου ενώ το μητρικό αλληλόμορφο δεν μεταγράφεται. Αντίθετα το μητρικό αλληλόμορφο του γονιδίου Η19 είναι εκείνο που εκφράζεται και αν και δεν κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη, θεωρείται πως έχει ιδιότητες που καταστέλλουν την ανάπτυξη. Ερευνητικές μελέτες έχουν καταδείξει συγκεκριμένες περιοχές των δύο γονιδίων που έχουν διαφορετικό προφίλ μεθυλίωσης σε κάθε αλληλόμορφο με αποτέλεσμα να ελέγχουν την έκφραση τους. Πιο συγκεκριμένα, μία περιοχή με διαφορετικό προφίλ μεθυλίωσης (Differentially Methylated Region DMR) που εδράζεται μεταξύ των δύο γονιδίων, είναι υπεύθυνη για την αντίθετη αποτύπωση των δύο γονιδίων. Αν η περιοχή αυτή είναι υπομεθυλιωμένη, τότε επιτρέπεται η σύνδεση της με τον παράγοντα CTC Factor (CTCF) ο οποίος εμποδίζει την δράση διεγερτών στους εκκινητές του IGF2 με αποτέλεσμα το IGF2 να μη μεταγράφεται και να μεταγράφεται το Η19. Αντίθετα αν η συγκεκριμένη περιοχή είναι μεθυλιωμένη η πρόσδεση του παράγοντα CTCF δεν επιτρέπεται με αποτέλεσμα οι διεγέρτες να επιδρούν στους εκκινητές του IGF2 και να μεταγράφεται το IGF2 και να μην εκφράζεται το Η19. Συνεπώς υπό φυσιολογικές συνθήκες το μητρικό αλληλόμορφο είναι υπομεθυλιωμένο και το IGF2 δεν μεταγράφεται σε αυτό ενώ μεταγράφεται το Η19. Το αντίθετο ισχύει για το πατρικό αλληλόμορφο.
Διαταραχές στην έκφραση των συγκεκριμένων γονιδίων έχουν συσχετιστεί με σύνδρομα διαταραχών της ανάπτυξης πριν και μετά τη γέννηση αλλά υπάρχουν ελάχιστα δεδομένα που να αφορούν το ρόλο τους στην ΕΥΑ. Οι διαταραχές στον ευαίσθητο επιγενετικό έλεγχο της λειτουργίας των γονιδίων αποτύπωσης, θα μπορούσε να αποτελέσει έναν σημαντικό συνδετικό κρίκο μεταξύ περιβαλλοντικών 12
παραγόντων και εμβρυϊκής ανάπτυξης. Στην παρούσα ερευνητική μελέτη διερευνήθηκε ο ρόλος των γονιδίων αποτύπωσης IGF2 και Η19 στην παθογένεση της ΕΥΑ. Πιο συγκεκριμένα η υπόθεση η οποία ελέγχθηκε είναι κατά πόσο τα συγκεκριμένα γονίδια τα οποία έχουν θεμελιώδη ρόλο στην πρώιμη εμβρυϊκή ανάπτυξη, εμφανίζουν ανώμαλη έκφραση σε πλακουντιακούς ιστούς κυήσεων με ΕΥΑ σε σύγκριση με την έκφραση σε πλακούντες από φυσιολογικές κυήσεις. Διερευνήσαμε ταυτόχρονα αν παρατηρούνται διαταραχές στον μηχανισμό αποτύπωσης που μπορεί να συσχετιστούν με ανώμαλη έκφραση. Τέλος μελετήσαμε το επιγενετικό προφίλ αυτών των γονιδίων στους ίδιους ιστούς και πιο συγκεκριμένα συγκρίναμε τα επίπεδα μεθυλίωσης συγκεκριμένων περιοχών των γονιδίων που αποτελούν ρυθμιστικές περιοχές της αποτύπωσης, στις δύο υπό μελέτη ομάδες. Η βασική υπόθεση που προσπαθήσαμε να επαληθεύσουμε, είναι κατά πόσο διαταραχές στο μηχανισμό μεθυλίωσης μπορεί να έχουν άμεση επίδραση στο μοντέλο αποτύπωσης των IGF2/H19 και κατά συνέπεια στην έκφραση τους, και κατά πόσο αυτή η αλυσιδωτή μοριακή βλάβη, εφόσον υπάρχει, μπορεί να επηρεάσει την ομαλή ανάπτυξη του εμβρύου.
ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ
Συλλογή Υλικού
Συλλέχθηκαν συνολικά 30 ιστοί που αποτελούσαν προϊόντα αποβολής πρώτου τριμήνου και 31 τεμάχια πλακουντιακού ιστού από κυήσεις με ΕΥΑ και 17 τεμάχια πλακουντιακοί ιστού από τελειόμηνες κυήσεις με ομαλή έκβαση που αποτελούσαν την ομάδα ελέγχου. Η διάγνωση της ενδομήτριας υπολειπόμενης ανάπτυξης είχε γίνει με διαδοχικές υπερηχογραφικές εκτιμήσεις κατά τη διάρκεια της κύησης. Το 13
πειραματικό μέρος πραγματοποιήθηκε στα δείγματα πλακουντιακού ιστού από τις δύο ομάδες κυήσεων.
Πειραματικό μέρος
Πραγματοποιήθηκε εκχύλιση DNA από τους πλακουντιακούς ιστούς με το πρωτόκολλο φαινόλης/χλωροφορμίου, και εκχύλιση RNA με το πρωτόκολλο του Trizol. Η ποσότητα του RNA υπολογίστηκε με φωτομέτρηση. Η διαδικασία της αντίστροφης μεταγραφής πραγματοποιήθηκε με το κιτ της Promega. Οι αντιδράσεις της real-time PCR πραγματοποιήθηκαν με το σύστημα Mx3000P real-time PCR system. Η έκφραση του δομικού γονιδίου Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) χρησιμοποιήθηκε για την ομαλοποίηση των επιπέδων έκφρασης των IGF2 και H19. Χρησιμοποιήθηκαν, τρία σετ primers για το IGF2 και ένα σετ primers για το Η19. Ελέγχθηκαν τρεις πολυμορφισμοί για το IGF2 και ένας για το Η19. Τα προιόντα της PCR ελέγχθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε τζελ αγαρόζης 3%. Η εξέταση δύο πολυμορφισμών έγινε μετά από πέψη με περιοριστικά ένζυμα.
Η ανάλυση της μεθυλίωσης έγινε με τη μέθοδο MethyLight μετά από μετατροπή του DNA με όξινο θειώδες νάτριο. Το ποσοστό των πλήρως μεθυλιωμένων μορίων σε μία συγκεκριμένη περιοχή του γονιδίου υπολογίστηκε μετά από διαίρεση του λόγου ΓΟΝΙΔΙΟ:COL2A1 ενός δείγματος με το λόγο ΓΟΝΙΔΙΟ:COL2A1 του DNA Sssl-επεξεργασμένων λευκών αιμοσφαιρίων και πολλαπλασιασμένο επί 100. Η συντόμευση PMR (Percentage of Methylated Reference) υποδηλώνει την παραπάνω μέτρηση.
14
ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ
Το βάρος γέννησης ήταν μικρότερο από την 5η εκατοστιαία θέση για όλες τις κυήσεις με ΕΥΑ και μεταξύ της 10ης και 90ης για της κυήσεις της ομάδας ελέγχου. Δεκατέσσερα IUGR δείγματα και 8 control ήταν ετερόζυγα για το H19. Δεκαέξι πλακούντες από την ομάδα των IUGR και 9 από την ομάδα ελέγχου ήταν ετερόζυγοι για τον IGF2. Από τα συνολικά 22 ετερόζυγα δείγματα για το Η19, απώλεια της αποτύπωσης (Loss Of Imprinting, LOI) διαπιστώθηκε σε 5 δείγματα, 4 από τα οποία ήταν φυσιολογικά και ένα παθολογικό. Από τα συνολικά 25 ετερόζυγα δείγματα για τον IGF2, διαπιστώθηκε απώλεια της αποτύπωσης σε 9 δείγματα, όλα προερχόμενα από την ομάδα με την ΕΥΑ.
Τα επίπεδα πλακουντιακής έκφρασης ήταν ελαττωμένα στην ομάδα των IUGR (P=0.01) για τον IGF2 και αυξημένα για το Η19 (P=0.04). Η στατιστική ανάλυση δεν έδειξε συσχέτιση της έκφρασης των δύο γονιδίων με άλλες παραμέτρους όπως εμβρυϊκή ανάπτυξη, χαρακτηριστικά της μητέρας, βαρύτητα της υπολειπόμενης ανάπτυξης ή ηλικία κύησης. Η έκφραση και των δύο γονιδίων δεν διέφερε σημαντικά μεταξύ των πλακουντιακών ιστών που είχαν φυσιολογική και ανώμαλη αποτύπωση.
Μελετήθηκαν 3 περιοχές που υπό κανονικές συνθήκες εμφανίζουν διαφορετικό βαθμό μεθυλίωσης μεταξύ μητρικού και πατρικού χρωμοσώματος (DMR). Η μία DMR που μελετήθηκε ήταν στους εκκινητές του γονιδίου IGF2 στα εξόνια 2/3, η άλλη περιοχή αφορούσε την DMR του εκκινητή του Η19 και τέλος την περιοχή που ελέγχει την αποτύπωση και των δύο γονιδίων (Imprinting Control Region ICR) η οποία βρίσκεται μεταξύ των δύο γονιδίων, πριν από τους εκκινητές του Η19. Οι πλακούντες με ΕΥΑ είχαν μικρότερη μέση τιμή PMR στους εκκινητές του IGF2 σε σχέση με την ομάδα ελέγχου (23.3% και 29.6% αντίστοιχα P=0,05). Οι τιμές της μεθυλίωσης δεν διέφεραν μεταξύ των δειγμάτων που είχαν απώλεια της 15
αποτύπωσης (LOI) και σε όσα είχαν φυσιολογική αποτύπωση (MOI). Επιπλέον, οι παθολογικοί πλακούντες είχαν χαμηλότερα επίπεδα μεθυλίωσης στους εκκινητές του H19 σε σχέση με την ομάδα ελέγχου (22.3% και 32.4% αντίστοιχα P=0.02). Παρόλα αυτά δεν υπήρξε συσχέτιση της μεθυλίωσης και των διαταραχών της αποτύπωσης. Δεν διαπιστώθηκε συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων μεθυλίωσης και των επιπέδων mRNA των αντίστοιχων γονιδίων και δια τις δύο περιοχές που μελετήθηκαν.
Τα ποσοστά μεθυλίωσης στην περιοχή που ελέγχει την αποτύπωση και των δύο γονιδίων (ICR) ήταν παρόμοια και στις δυο ομάδες δειγμάτων που μελετήθηκαν. Αν και οι πλακούντες που είχαν απώλεια της αποτύπωσης για τον IGF2, εμφάνιζαν υψηλότερα ποσοστά μεθυλίωσης σε σχέση με όσα διατηρούσαν τη μεθυλίωση, η διαφορά αυτή δεν ήταν σημαντική.
ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ
Από την παρούσα μελέτη προκύπτουν συμπεράσματα αλλά ανακύπτουν και κάποια ερωτήματα. Η μειωμένη έκφραση του IGF2 αποτελεί ένα εύρημα το οποίο έχει αναφερθεί και παλιότερα σε κυήσεις με ενδομήτρια υπολειπόμενη ανάπτυξη. Έχει βρεθεί πως η μειωμένη έκφραση του συγκεκριμένου γονιδίου έχει συσχετιστεί με μειωμένη ικανότητα διάχυσης θρεπτικών ουσιών από τον πλακούντα προς το έμβρυο. Η μειωμένη έκφραση του IGF2 που βρήκαμε στην παρούσα μελέτη, μπορεί να συνδέεται με τον αιτιολογικό μηχανισμό της ΕΥΑ ή να αποτελεί αποτέλεσμα της πλακουντιακής δυσλειτουργίας. Όσον αφορά τη αυξημένη έκφραση του Η19 στους πλακούντες κυήσεων με ΕΥΑ, αποτελεί ένα καινούριο εύρημα, που όμως έχει ήδη συσχετιστεί με καθυστερημένη ανάπτυξη μετά τον τοκετό σε πειραματικά μοντέλα με ποντίκια.
16
Η διαταραχή της αποτύπωσης που είχε ως αποτέλεσμα την διαλληλική έκφραση του IGF2 παρατηρήθηκε αποκλειστικά σε παθολογικούς πλακούντες. Η ανωμαλία αυτή έχει αναφερθεί και σε άλλες παθολογικές καταστάσεις που αφορούν τον πλακούντα όπως η μύλη κύηση και η προεκλαμψία. Δεν υπήρξε όμως η αναμενόμενη αυξημένη έκφραση του IGF2 στα δείγματα που είχαν απώλεια της αποτύπωσης.
Η ανάλυση του ποσοστού της μεθυλίωσης στην περιοχή των εκκινητών του IGF2 έδειξε μειωμένο ποσοστό μεθυλίωσης στους πλακούντες με ΕΥΑ σε σχέση με αυτούς της ομάδας ελέγχου. Η υπομεθυλίωση στη συγκεκριμένη περιοχή μπορεί να συσχετιστεί με την απώλεια της αποτύπωσης των παθολογικών δειγμάτων, δεν μπορεί όμως να εξηγήσει τη μειωμένη έκφραση του IGF2 στην ίδια ομάδα. Επιπρόσθετα, δεν βρέθηκε να υπάρχει συσχέτιση της υπομεθυλίωσης με την διαταραχή της αποτύπωσης στα δείγματα με ΕΥΑ.
Χαμηλότερα επίπεδα μεθυλίωσης διαπιστώθηκαν και στην περιοχή των εκκινητών του Η19 στην ομάδα των παθολογικών πλακούντων. Αν και το συγκεκριμένο γεγονός θα μπορούσε να εξηγήσει την αυξημένη έκφραση του Η19, εντούτοις δε βρέθηκε συσχέτιση μεταξύ επιπέδων του mRNA και των PMR.
Τέλος, ένα πολύ σημαντικό κομμάτι της μελέτης ήταν η ανάλυση της μεθυλίωσης της περιοχής που ελέγχει την αποτύπωση του IGF2 και του Η19. Τα παθολογικά δείγματα πλακούντων είχαν μικρότερα ποσοστά μεθυλίωσης σε σχέση με τα φυσιολογικά, αλλά σε μη στατιστικά σημαντικό βαθμό. Οι μετρήσεις των PMR δεν σχετίζονταν με τα επίπεδα mRNA κανενός από τα δύο γονίδια που μελετήθηκαν. Με σκοπό να διερευνήσουμε κατά πόσο η υπομεθυλίωση στην συγκεκριμένη περιοχή μπορεί να συσχετίζεται με διαταραχές της αποτύπωσης, αναλύσαμε τα ποσοστά μεθυλίωσης των δειγμάτων που εμφάνισαν απώλεια της αποτύπωσης προκειμένου για το IGF2 σε σχέση με όσα είχαν φυσιολογική 17
αποτύπωση. Αν και τα δείγματα με LOI είχαν υψηλότερα επίπεδα μεθυλίωσης σε σχέση με όσα δεν εμφάνιζαν κάποια διαταραχή, η διαφορά αυτή δεν ήταν σημαντική.
Είναι γεγονός πως οι μέχρι σήμερα γνώσεις μας όσον αφορά τους μηχανισμούς που ρυθμίζουν την αποτύπωση, είναι ανεπαρκείς. Τα αποτελέσματα της μελέτης μας δείχνουν μία πιθανή συσχέτιση μεταξύ ανώμαλης μεθυλίωσης του DNA και των διαταραχών την αποτύπωσης σε πλακούντες κυήσεων με ενδομήτρια υπολειπόμενη ανάπτυξη. Η μεταγραφή, η αποτύπωση και η μεθυλίωση είναι τρεις μοριακοί μηχανισμοί που προφανώς σχετίζονται, αλλά πιθανότατα μεσολαβούν και άλλες διεργασίες σε αυτή την αλυσίδα φαινομένων. Εφόσον οι επιγενετικοί μηχανισμοί που ελέγχουν την έκφραση των γονιδίων αποτύπωσης στον πλακούντα δεν είναι προφανείς, είναι αναγκαίες περισσότερες μελέτες για να διερευνηθεί ο ρόλος των γονιδίων αποτύπωσης στην παθοφυσιολογία των διαταραχών της εμβρυϊκής ανάπτυξης.
|
Αναζήτηση
