| Περίληψη |
Ο Tumor necrosis factor (TNF), μια πλειοτροπική κυτταροκίνη που εμπλέκεται σε ένα ευρύ φάσμα φλεγμονωδών και ανοσολογικών απαντήσεων, ασκεί τις βιολογικές του δράσεις μέσω δύο μεμβρανικών υποδοχέων, του TNFR1, βάρους 55-kD, και του TNFR2, βάρους 75-kD. Και οι δύο TNF Receptors (TNFRs) μπορούν να μεσολαβήσουν τον κυτταρικό θάνατο, μέσω διαφόρων μηχανισμών. Η διέγερση του TNFR1 μπορεί επίσης να εμποδίσει την απόπτωση μέσω επαγωγής του μεταγραφικού παράγοντα NF-kappaB, και ειδικότερα του ετεροδιμερούς p50/p65. Κατόπιν επιδράσεως του TNF, το p65 υφίσταται διάφορες μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις, όπως φωσφορυλίωση των σερινών 536 και 468, και μεταβαίνει στον πυρήνα, όπου συνήθως επάγει την έκφραση πολλών αντιαποπτωτικών γονιδίων. Αναλόγως όμως του κυτταρικού τύπου και του ερεθίσματος που προκάλεσε την ενεργοποίησή του, ο NF-kappaB μπορεί επίσης να έχει και προαποπτωτική δράση.
Ο TNF στο ήπαρ παράγεται κυρίως από τα κύτταρα Kupffer (KC), τα εγχώρια μακροφάγα, και διαδραματίζει κυρίαρχο ρόλο στην ομοιόσταση και παθοφυσιολογία του ήπατος, αφού μπορεί να προάγει είτε το θάνατο είτε τον πολλαπλασιασμό των ηπατοκυττάρων. Τα KC συμβάλλουν στην άμυνα απέναντι στην ανάπτυξη ηπατικών μεταστάσεων, σε άλλες όμως περιπτώσεις μπορούν και να ευνοήσουν την ανάπτυξη καρκίνου του ήπατος. Το ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (ΗΚΚ), ο κύριος ιστολογικός τύπος του καρκίνου ήπατος, είναι ένα μείζον αίτιο νοσηρότητας και θνητότητας παγκοσμίως. Η εγγενής αντοχή που παρουσιάζει στα καθιερωμένα θεραπευτικά σχήματα επιβάλλει την αναζήτηση νέων θεραπειών. Μια πληθώρα κλινικών και εργαστηριακών δεδομένων υποδηλώνουν ότι η Οκτρεοτίδη, ένα ισχυρό συνθετικό ανάλογο σωματοστατίνης με αντιμιτωτικές, αντιεκκριτικές και ανοσοτροποποιητικές ιδιότητες, είναι ένας πολλά υποσχόμενος αντινεοπλασματικός παράγοντας. Έχει αναφερθεί ότι η Οκτρεοτίδη παρατείνει την επιβίωση σε περίπου 40% των ασθενών με ανεγχείρητο ΗΚΚ. Αν και η αποτελεσματικότητά της έχει αμφισβητηθεί από κάποιες μελέτες, αυτές έχουν δεχτεί κριτική για την κακή επιλογή των συμμετεχόντων ασθενών.
Προηγούμενες μελέτες στο εργαστήριό μας έχουν καταδείξει ότι η Οκτρετίδη εμποδίζει τον πολλαπλασιασμό της κυτταρικής σειράς ΗΚΚ HepG2 και επηρεάζει στα KC την παραγωγή προ-
και αντιινωτικών παραγόντων, μεσολαβητών της φλεγμονής, χημειοκινών και πρωτεϊνών σχετιζόμενων με την απόπτωση.
Για την περαιτέρω διερεύνηση των μηχανισμών αντινεοπλασματικής δράσης της Οκτρεοτίδης, μελετήσαμε στην παρούσα Διατριβή την επίδρασή της, στη θεραπευτική συγκέντρωση 10-8 Μ, στην έκφραση των TNFRs, στην ενεργοποίηση του NF-kappaB και στην αποπτωτική απάντηση των KC και HepG2/Hep3B κυτταρικών σειρών ΗΚΚ απέναντι στον TNF.
Τα KC απομονώθηκαν από ήπαρ αρουραίων με φυγόκεντρο έκλουση. Η έκφραση των TNFR1 και TNFR2 μελετήθηκε με RT-PCR, ποσοτική PCR, Western Blot και ανοσοφθορισμό. Η έκφραση mRNA του TNF στα KC μελετήθηκε επίσης με ημιποσοτική PCR. Η ενδοκυττάρια εντόπιση του NF-kappaB στα HepG2/Hep3B ανιχνεύτηκε με ανοσοφθορισμό και η ποσοτικοποίηση των επιπέδων ολικού και ενεργοποιημένου (φωσφορυλιωμένου στις σερίνες 536 και 468) p65 έγινε με δοκιμασία ELISA. Η απόπτωση εκτιμήθηκε με ποσοτικοποίηση των νουκλεοσωμάτων στο κυτταρόπλασμα των αποπτωτικών κυττάρων, καθώς και με δοκιμασία TUNEL.
Τα πειράματά μας δείχνουν ότι το mRNA των TNFR1, TNFR2 και TNF εκφράζεται σε βασικά επίπεδα στα KC. Η Οκτρεοτίδη δεν επηρεάζει την έκφραση του TNF, αλλά επάγει την έκφραση των TNFRs, ιδιαίτερα του TNFR2.
Ο TNF μόνος του δεν προκαλεί την απόπτωση των KC. Η Οκτρεοτίδη όμως αυξάνει σημαντικά την απόπτωσή τους και αυτό θα μπορούσε να αποτελεί έναν μηχανισμό της αντινεοπλασματικής της δράσης. Υποθέτουμε ότι αυτή η δράση της οφείλεται πιθανά στην επαγωγή του TNFR2, ενώ το γεγονός ότι η συνεπίδραση TNF ελαττώνει την απόπτωση οφείλεται ίσως στη διέγερση του TNFR1.
Δείξαμε επίσης ότι ο TNFR1, αλλά όχι ο TNFR2 εκφράζεται σε βασικά επίπεδα στα HepG2 και Hep3B. Η Οκτρεοτίδη προκάλεσε μια πρώιμη καταστολή της έκφρασης του TNFR1 στα HepG2 και μια όψιμη καταστολή της στα Hep3B.
Ο TNF επάγει τη μετάβαση του NF-kappaB στον πυρήνα, ισχυρότερα στα Hep3B, χωρίς αυτή να επηρεάζεται από την Οκτρεοτίδη. Ο TNF αυξάνει σημαντικά και τη φωσφορυλίωση των p65 Ser536 και p65 Ser468, επίσης ισχυρότερα στα Hep3B. Η Οκτρεοτίδη ελαττώνει σημαντικά την TNF-επαγόμενη φωσφορυλίωση της p65 Ser536 μόνο στα HepG2, ενώ μόνο στα Hep3B φωσφορυλιώνει σημαντικά την p65 Ser468.
Η Οκτρεοτίδη ή ο TNF μόνοι τους δεν επηρεάζουν σημαντικά την απόπτωση των HepG2, αλλά ο TNF επάγει την απόπτωση των Hep3B. Η συνεπίδραση Οκτρεοτίδης και TNF αυξάνει την απόπτωση των HepG2 και ελαττώνει την TNF-επαγόμενη απόπτωση των
Hep3B.
Αυτή η διαφορετική επίδραση της Οκτρεοτίδης στην απόπτωση των δύο κυτταρικών σειρών θα μπορούσε να οφείλεται στη διαφορετική επίδραση της στην έκφραση του TNFR1 και να εξηγήσει γιατί δεν ανταποκρίνονται όλοι οι ασθενείς με ΗΚΚ στη θεραπεία με τα ανάλογα σωματοστατίνης. Η ελαφρά απόπτωση που προκαλεί η Οκτρεοτίδη στα Hep3B ίσως οφείλεται στην επαγωγή της φωσφορυλίωσης της p65 Ser468. Αν και η TNF-επαγόμενη μετάβαση του NF-kappaB στις δύο κυτταρικές σειρές μοιάζει να να ευνοεί την απόπτωση, η φωσφορυλίωση της p65 Ser536 παίζει μάλλον προστατευτικό ρόλο, καθώς η αναστολή αυτής της φωσφορυλίωσης από την Οκτρεοτίδη στα HepG2 μόνο σχετίζεται με σημαντική αναστολή της TNF-επαγόμενης απόπτωσης.
Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η Οκτρεοτίδη στο ΗΚΚ μπορεί να δρα εμμέσως, μέσω επαγωγής της απόπτωσης των Kupffer και των καρκινικών κυττάρων από τον TNF. Περαιτέρω μελέτες απαιτούνται για να επιβεβαιώσουν αυτήν την υπόθεση και να αποσαφηνίσουν πλήρως τους μηχανισμούς αντινεοπλασματικής δράσης της Οκτρεοτίδης.
|
Αναζήτηση
