| Περίληψη |
Εισαγωγή: Ο διηθητικός καρκίνος του μαστού είναι η πιο συχνή κακοήθεια στις γυναίκες,
αντιπροσωπεύοντας το 28% των νέων περιπτώσεων καρκίνου και το 15% των θανάτων
από καρκίνο. Λόγω της μείωσης των ποσοστών θνησιμότητας, τα οποία οφείλονται στην
ευρεία εφαρμογή του προσυμπτωματικού ελέγχου με μαστογραφία και στην επικουρική
θεραπεία, περισσότερες γυναίκες επιβιώνουν στις μέρες μας από τη νόσο. Δεδομένου ότι η
μεταστατική νόσος θεωρείται ανίατη, η έγκαιρη αναγνώριση και θεραπεία της δυνητικά
ακόμα ιάσιμης ελάχιστης υπολειπόμενης νόσου είναι ένας από τους σημαντικότερους
στόχους της κλινικής έρευνας των ασθενών και προϋποθέτει την κατανόηση σε βάθος των
προτύπων υποτροπής.
Η παρουσία καρκινικών κυττάρων στο μυελό των οστών και κυκλοφορούντων
καρκινικών κυττάρων (ΚΚΚ) στο περιφερικό αίμα των ασθενών με πρώϊμο καρκίνο του
μαστού έχουν αποδειχθεί ως ανεξάρτητοι δυσμενείς προγνωστικοί παράγοντες για
υποτροπή και θάνατο από τη νόσο. Η ανοσοκυτταροχημεία με τη χρηση αντισωμάτων
έναντι πρωτεϊνών που εκφράζονται σε επιθηλιακά αλλά όχι σε μεσεγχυματικά κύτταρα
χρησιμοποιείται ευρέως για την ανίχνευση των ΚΚΚ. Ωστόσο, η ανίχνευση της γονιδιακής
έκφρασης συγκεκριμένων επιθηλιακών δεικτών με τη χρήση qPCR φαίνεται να έχει
υψηλότερη διαγνωστική ευαισθησία.
Η κυτταροκερατίνη-19 (Cytokeratin-19, CK-19) έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως για την
ανίχνευση των καρκινικών κυττάρων του μαστού σε μεσεγχυματικούς ιστούς και φαίνεται να
είναι ευαίσθητος και αξιόπιστος βιοδείκτης σε ασθενείς με πρώϊμη και μεταστατική νόσο.
Αρκετές μελέτες έχουν δείξει την προγνωστική σημασία της ανίχνευσης CK-19 mRNA-
θετικών ΚΚΚ σε ασθενείς με πρώϊμο καρκίνο του μαστού. Ωστόσο, σε όλες αυτές τις μελέτες
έχει μελετηθεί η προγνωστική αξία των ΚΚΚ κατά την αρχική διάγνωση και πριν από την
έναρξη ή/και μετά την ολοκλήρωση της συμπληρωματικής χημειοθεραπείας. Μόνο λίγα
δεδομένα υπάρχουν σχετικά με την κλινική σημασία της ανίχνευσης καρκινικών κυττάρων
στο μυελό των οστών, αλλά καμία για τα ΚΚΚ κατά τη διάρκεια της περιόδου
παρακολούθησης μετά την ολοκλήρωση της συμπληρωματικής χημειοθεραπείας. Οι
μελέτες αυτές ανέδειξαν την δυσμενή κλινική έκβαση των ασθενών με ανιχνεύσιμα κύτταρα
του όγκου στο μυελό των οστών.
14
Emmanouil Saloustros Thesis for Doctoral Degree 2013
Στην παρούσα μελέτη, επιδιώξαμε να αξιολογήσουμε την κλινική σημασία της
ανίχνευσης των CK-19 mRNA-θετικών ΚΚΚ με την εφαρμογή RT-qPCR σε διαφορετικά
χρονικά σημεία κατά την περίοδο παρακολούθησης μετά την ολοκλήρωση της
συμπληρωματικής χημειοθεραπείας, σε ασθενείς με πρώϊμο καρκίνο του μαστού.
Υποθέσαμε ότι οι ασθενείς που παρουσιάζουν ανιχνεύσιμο CK-19 mRNA κατά τη διάρκεια
της παρακολούθησης, μετά τη χορήγηση επικουρικής θεραπείας έχουν αυξημένο κίνδυνο
όψιμης υποτροπής της νόσου (υποτροπή τουλάχιστον δύο χρόνια μετά τη λήξη της
συμπληρωματικής χημειοθεραπείας) και θανάτου από τη νόσο.
Ασθενείς – Μέθοδοι: Πραγματοποιήθηκε μια αναδρομική ανάλυση δεδομένων που
συλλέχθηκαν προοπτικά στο πλαίσιο μιας συνεχιζόμενης μελέτης που έχει ξεκινήσει πριν
πολλά χρόνια στο Εργαστήριο Βιολογίας του Καρκίνου. Γυναίκες με χειρουργήσιμο καρκίνο
του μαστού (στάδιο Ι έως ΙΙΙ), οι οποίες ήταν υπό παρακολούθηση και δεν είχαν
παρουσιάσει υποτροπή της νόσου κατά τη διάρκεια των δύο πρώτων ετών μετά το πέρας
της επικουρικής χημειοθεραπείας ήταν κατάλληλες για τη μελέτη. Μετά την ολοκλήρωση της
συμπληρωματικής χημειοθεραπείας, οι ασθενείς έλαβαν συμπληρωματική ακτινοθεραπεία
και ορμονική θεραπεία σύμφωνα με τα χαρακτηριστικά της νόσου. Η εξέταση δειγμάτων για
CK-19 mRNA-θετικών ΚΚΚ γίνονταν σε συγκεκριμένα χρονικά σημεία μετά την ολοκλήρωση
της συμπληρωματικής χημειοθεραπείας για μια 5-ετή περίοδο παρακολούθησης. Το πρώτο
δείγμα αίματος λαμβάνονταν 3 μήνες μετά το τέλος της χημειοθεραπείας και στη συνέχεια
κάθε 6 μήνες έως τη συμπλήρωση 5 ετών.
Οι ασθενείς ταξινομήθηκαν σε τέσσερις ομάδες ανάλογα με την ανίχνευση ή όχι ΚΚΚ
κατά τα δύο πρώτα χρόνια και τα επόμενα τρία χρόνια παρακολούθησης (όπως επίμονα
αρνητική, επίμονα θετική, αρνητικό μετατροπή σε θετικό και το αντίθετο). Χρησιμοποιώντας
τον ορισμό αυτό, οι ασθενείς ταξινομήθηκαν στην "επίμονα ΚΚΚ-αρνητική" ομάδα, αν δεν
είχαν κανένα θετικό δείγμα αίματος για CK-19 mRNA σε όλη την 5-ετή περίοδο
παρακολούθησης. Από την άλλη πλευρά, η «επίμονα ΚΚΚ-θετική» ομάδα περιελάμβανε
ασθενείς με τουλάχιστον ένα θετικό δείγμα αίματος για CK-19 mRNA στα πρώτα 2 έτη και
τουλάχιστον άλλο ένα κατά τα επόμενα 3 χρόνια παρακολούθησης. Κατά συνέπεια, οι
ασθενείς στην "CTC-αρνητική/θετική" ομάδα δεν είχε θετικά δείγματα στα δύο πρώτα χρόνια,
αλλά τουλάχιστον ένα θετικό δείγμα στα επόμενα 3 χρόνια. Το αντίθετο ίσχυε για την "CTC-
θετική/αρνητική ομάδα.
15
Emmanouil Saloustros Thesis for Doctoral Degree 2013
Είκοσι χιλιοστόλιτρα (ml) περιφερικού αίματος συλλέγονταν σε κάθε επίσκεψη σε
σωληνάρια που περιείχαν EDTA. Για να αποφεύγεται η επιμόλυνση με τα επιθηλιακά
κύτταρα από το δέρμα, όλα τα δείγματα αίματος λαμβάνονταν στα μέσα της παρακέντησης
φλέβας και αφού τα πρώτα 5 mL αίματος απορρίπτονταν. Μονοπύρηνα κύτταρα του
περιφερικού αίματος λαμβάνονταν μετά από διαβαθμιζόμενη φυγοκέντρηση
χρησιμοποιώντας Ficoll-Hypaque. Η απομόνωση του RNA γίνονταν με τη χρήση των
αντιδραστηρίων Trizol LS (Gibco-BRL, Grand Island, NY, Η.Π.Α.). Το απομονωμένο RNA
διαλύονταν σε diethylpyrocarbonate επεξεργασμένο νερό και αποθηκεύονταν στους -80°C
μέχρι να χρησιμοποιηθεί. Η αντίστροφη μεταγραφή του RNA γίνονταν με την μέθοδο
Thermoscript RT-PCR (Life Technologies-Invitrogen, Ηνωμένο Βασίλειο). Το
συμπληρωματικό DNA (cDNA) συνθέτοταν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η
μέθοδος RT-qPCR μέθοδος για την ανίχνευση της έκφρασης της CK-19 έχει περιγραφεί
προηγουμένως.
Η επιβίωση ελεύθερη νόσου (ΕΕΝ), η οποία ορίζεται ως ο χρόνος από την έναρξη
της μελέτης μέχρι την ημέρα υποτροπής της νόσου και η συνολική επιβίωση (OΕ) που
μετριέται από την έναρξη της μελέτης μέχρι το θάνατο ανεξαρτήτως αιτιολογίας ήταν τα
κύρια καταληκτικά σημεία της μελέτης. Κλινικοπαθολογοανατομικοί παράγοντες που είναι
γνωστό ότι σχετίζονται με την πρόγνωση, όπως η εμμηνοπαυσιακή κατάσταση
(προεμμηνοπαυσιακές vs μετεμμηνοπαυσιακές), το μέγεθος του όγκου (Τ1 vs Τ2-3), ο
αριθμός των διηθημένων μασχαλιαίων λεμφαδένων (0-3 vs΄&γε΄΄ 4), ο βαθμός διαφοροποίησης
(grade: 1-2 vs 3), οι οιστρογονικοί υποδοχείς (ER) (αρνητικοί έναντι θετικών), οι υποδοχείς
προγεστερόνης (PR) (αρνητικοί έναντι θετικών) και η ενίσχυση του HER-2/neu (αρνητικό
έναντι θετικού) εξετάστηκαν σε μονοπαραγοντική και πολυπαραγοντική ανάλυση.
Αποτελέσματα: Συνολικά 455 διαδοχικοί ασθενείς με διάγνωση καρκίνου του μαστού που
αντιμετωπίστηκαν θεραπευτικά στην κλινική Παθολογικής-Ογκολογίας του Πανεπιστημιακού
Νοσοκομείου Ηρακλείου μεταξύ Ιανουαρίου 1997 και Δεκεμβρίου 2004 εξετάστηκαν για την
ένταξη τους στη μελέτη αυτή. Εκατόν σαράντα τρεις ασθενείς αποκλείστηκαν και 312
συμπεριλήφθηκαν στη μελέτη. Οι ασθενείς που βρέθηκαν θετικοί στην παρουσία ΚΚΚ δεν
διέφεραν σε σχέση με όσες παρέμειναν αρνητικές σε ότι αφορά στα χαρακτηριστικά τους
[ηλικία (p=0.197), εμμηνοπαυσιακή κατάσταση (p=0.372)] ή στα χαρακτηριστικά των όγκων
16
Emmanouil Saloustros Thesis for Doctoral Degree 2013
τους [μέγεθος (p=0.637), διήθηση λεμφαδένων (p=0.082), ιστοπαθολογική διαφοροποίηση
(p=0.746) και κατάσταση των ορμονικών υποδοχέων (p =0.156)].
CK-19 mRNA-θετικά κύτταρα ανιχνεύθηκαν σε 232 ασθενείς (74.4%) σε
οποιοδήποτε χρονικό σημείο κατά τη διάρκεια της 5ετούς παρακολούθησης, ενώ 80
ασθενείς (25.6%) παρέμειναν «αρνητικοί» καθ 'όλη την ίδια περίοδο (επίμονα αρνητική
ομάδα). Πιο συγκεκριμένα, 99 ασθενείς (31.7%) είχαν επίμονα ανιχνεύσιμα CK-19 mRNA-
θετικά κύτταρα τόσο κατά τη διάρκεια των δύο πρώτων όσο και τα επόμενα τρία χρόνια
παρακολούθησης (επίμονα θετική ομάδα). Μια αλλαγή του CK-19 mRNA παρατηρήθηκε σε
σχεδόν μισές από τις ασθενείς (133 ασθενείς ή 42.6%). Από αυτές, 64 ασθενείς (20.5%) με
ανιχνεύσιμα αρχικά CK-19 mRNA-θετικά κύτταρα κατά τη διάρκεια των πρώτων 24 μηνών
έγιναν «CTC αρνητικές» στη συνέχεια (θετική/αρνητική ομάδα), ενώ 69 ασθενείς (22.1%)
που ήταν αρχικά «CTC αρνητικές» έγιναν «CTC θετικές» (αρνητική/θετική ομάδα).
Μετά από μια διάμεση περίοδο παρακολούθησης 107 μηνών (εύρος: 38 - 161 μήνες),
63 ασθενείς (20.2%) είχαν αναπτύξει απομακρυσμένη (n=56; 88.8%) ή τοπική υποτροπή
(n=7; 11.2%) . Σε σύγκριση με την «επίμονα αρνητική» ομάδα ασθενών, μόνο η ομάδα των
«επίμονα θετικών» είχε σημαντικά υψηλότερο κίνδυνο υποτροπής της νόσου (36.4% έναντι
11.2%, p΄&λτ.001). Στην πραγματικότητα, ο κίνδυνος επανεμφάνισης της νόσου ήταν
υψηλότερος σε ασθενείς με επίμονα θετικά ΚΚΚ (36.4% έναντι 7.8%, p&λτ0.001 και 36.4%
έναντι 18.8%, p=0.016 σε σύγκριση με θετική/αρνητική και αρνητική/θετική ομάδα,
αντίστοιχα).
Τα ποσοστά 5-ετούς ΕΕΝ ήταν 82.5% έναντι 92.7% για τις επίμονα θετικές και
επίμονα-αρνητικές ασθενείς, αντίστοιχα. Επιπλέον οι επίμονα θετικές ασθενείς είχαν
σημαντικά μικρότερη ΕΕΝ συγκριτικά με τις επίμονα αρνητικές ασθενείς (p΄&λτ0.001). Παρά το
γεγονός ότι καμία ομάδα δεν έχει φθάσει στη διάμεση ΕΕΝ, υπήρξε μια σταδιακή μείωση
της ΕΕΝ για τις τέσσερις ομάδες των ασθενών, σύμφωνα με την ανίχνευση των CK-19
mRNA-θετικών ΚΚΚ κατά τα 5 χρόνια παρακολούθησης.
Σαράντα-μία ασθενείς (13.1%) απεβίωσαν κατά τη διάρκεια της παρακολούθησης,
ως συνέπεια της εξέλιξης της νόσου. Είκοσι τέσσερις (58.5%) και πέντε (12.2%) από αυτούς
τους θανάτους συνέβησαν στην επίμονα-θετική και επίμονα-αρνητική ομάδα, αντίστοιχα
(p=0.001). Η 10-ετής συνολική επιβίωση ήταν 81.4% για τις επίμονα θετικές έναντι 96.7%
για τις επίμονα αρνητικές ασθενείς. Η εκτιμώμενη διάμεση συνολική επιβίωση ήταν
17
Emmanouil Saloustros Thesis for Doctoral Degree 2013
σημαντικά μικρότερη για τις επίμονα θετικές σε σύγκριση με τις επίμονα αρνητικές ασθενείς
(p=0.013).
Καθώς οι ασθενείς υποβλήθηκαν σε σειρά μετρήσεων των CK-19 mRNA-θετικών
ΚΚΚ, αναλύθηκαν τα δεδομένα για να απαντηθεί το ερώτημα αν το αθροιστικό αποτέλεσμα
των θετικών μετρήσεων ανά ασθενή προσφέρει επιπλέον προγνωστική πληροφορία.
Μεταξύ των ασθενών με θετικές μετρήσεις 38.7% (κατά τη διάρκεια των δύο πρώτων ετών
της παρακολούθησης), 24.4% (κατά τα επόμενα 3 έτη) και 57.3% (κατά τη διάρκεια όλων
των 5 ετών) είχαν δύο ή περισσότερα θετικά αποτελέσματα. Δεν βρέθηκε διαφορά στην
ελεύθερη νόσου επιβίωση μεταξύ των ομάδων με διαφορετικό συνολικό αριθμό θετικών
τεστ, πιθανώς λόγω του μικρού αριθμού των ασθενών και συμβάντων σε κάθε ομάδα.
Δεδομένης της προγνωστικής σημασίας της ανίχνευσης των ΚΚΚ πριν από τη
χορήγηση συμπληρωματικής χημειοθεραπείας, εξετάσθηκε το ερώτημα αν θα μπορούσε να
προσφέρει πρόσθετη προγνωστική πληροφορία με αυτό της διαδοχικής μέτρησης των ΚΚΚ
κατά τη διάρκεια της παρακολούθησης. Για το σκοπό αυτό, μελετήθηκε η κατάσταση των
ΚΚΚ προ-χημειοθεραπείας, όλων των ασθενών που περιλαμβάνονται στην παρούσα
ανάλυση. Δεν προέκυψε διαφορά στο ποσοστό ανίχνευσης των CK-19 mRNA-θετικών ΚΚΚ
μεταξύ των τεσσάρων ομάδων (Pearson Chi-square, p=0.320). Είναι ενδιαφέρον, ότι οι
«επίμονα θετικές» ασθενείς με ανιχνεύσιμα CK-19 mRNA-θετικά ΚΚΚ πριν από τη
χορήγηση συμπληρωματικής χημειοθεραπείας είχαν μικρότερη ΕΕΝ, αλλά όχι συνολική
επιβίωση (OΕ) σε σύγκριση με τους ασθενείς της ίδιας ομάδας που βρέθηκαν αρνητικές για
ΚΚΚ σε μέτρηση πριν την έναρξη της χημειοθεραπείας.
Τέλος, έγινε ανάλυση υποομάδων ανάλογα με την ορμονική κατάσταση του
πρωτοπαθούς όγκου. Είναι ενδιαφέρον, ότι η «επίμονα θετική» ομάδα ασθενών με όγκους
είτε θετικούς είτε αρνητικούς για ορμονικούς υποδοχείς είχαν σημαντικά υψηλότερο
ποσοστό υποτροπής, κίνδυνο θανάτου και μικρότερη ΕΕΝ συγκριτικά με τις «επίμονα
αρνητικές» ασθενείς (p=0.039 και p=0.004 για επίμονα θετικές vs επίμονα αρνητικές
ασθενείς με ER/PR αρνητικούς και ER ή/και PR θετικούς όγκους, αντίστοιχα). Ωστόσο, η
συνολική επιβίωση ήταν μικρότερη μόνο για τις «επίμονα θετικές» ασθενείς με ER/PR
αρνητικούς όγκους (p =0.035).
Η επίμονη ανίχνευση των CK-19 mRNA-θετικών ΚΚΚ κατά τη διάρκεια της
παρακολούθησης μετά την ολοκλήρωση της συμπληρωματικής χημειοθεραπείας, το
18
Emmanouil Saloustros Thesis for Doctoral Degree 2013
μέγεθος του όγκου μεγαλύτερο από 2.0 cm, η διήθηση περισσοτέρων από 3 μασχαλιαίων
λεμφαδένων και η μετεμμηνοπαυσιακή κατάσταση σχετίζονταν με σημαντικά μικρότερη
ΕΕΝ και ΟΕ σε μονοπαραγοντική ανάλυση. Η πολυπαραγοντική ανάλυση έδειξε ότι η
επίμονη ανίχνευση των CK-19 mRNA-θετικών ΚΚΚ, το μέγεθος του όγκου και περισσότεροι
από 3 διηθημένους μασχαλιαίους λεμφαδένες ήταν ανεξάρτητοι προγνωστικοί παράγοντες
για μικρότερη ΕΕΝ και ΟΕ.
Συμπέρασμα: Τα αποτελέσματα αυτά αποτελούν την πρώτη ένδειξη για την προβλεπτική
αξία της ανίχνευσης των CK-19 mRNA-θετικών ΚΚΚ κατά την παρακολούθηση ασθενών
που ολοκλήρωσαν την τοπική θεραπεία και συστηματική χημειοθεραπεία. Τα ευρήματα
αυτά υποστηρίζουν το ρόλο της παρακολούθησης των ΚΚΚ, ως συμπλήρωμα του ιστορικού,
της φυσικής εξέτασης και των ακτινολογικών μεθόδων για την αξιολόγηση της κατάστασης
της νόσου κατά τη διάρκεια της παρακολούθησης ασθενών με πρώιμο καρκίνο του μαστού.
|
Αναζήτηση
