| Περίληψη |
B. Περίληψη ειδικού μέρους
1. Μελέτη της επίδρασης της ραπαμυκίνης στη δομή και λειτουργία των επιθηλιακών σπειραματικών κυττάρων σε φυσιολογικά ποντίκια
Εισαγωγή: Στα φυσιολογικά νεφρά η ραπαμυκίνη θεωρείται μη νεφροτοξική αλλά η άποψη αυτή στηρίχθηκε σε ορισμένα μόνο είδη ζώων. Σε πάσχοντα νεφρά η ραπαμυκίνη είναι άλλοτε ωφέλιμη και άλλοτε βλαπτική, αναλόγως του τύπου της νεφρικής βλάβης. Μία πιθανή εξήγηση για τα αντιφατικά αποτελέσματα αποτελεί ίσως η δόση που χρησιμοποιείται καθώς και η διάρκεια χορήγησης.
Ο στόχος της παρούσας μελέτης ήταν να εξετάσουμε α) το αν η ραπαμυκίνη (σιρολίμη) είναι η όχι νεφροτοξική σε φυσιολογικά ποντίκια. Balb/c. β) να καθορίσουμε τις κλινικές εκδηλώσεις της νεφροτοξικότητας, δηλαδή εμφάνιση πρωτεϊνουρίας ή μείωση της σπειραματικής διήθησης. γ) στην περίπτωση που η ραπαμυκίνη είναι νεφροτοξική να καθορίσουμε το αν η τοξικότητα είναι δοσοεξαρτώμενη ή χρονοεξαρτώμενη. δ) στην περίπτωση που η ραπαμυκίνη προκαλεί σπειραματική λευκωματουρία να μελετήσουμε τους μηχανισμούς δυσλειτουργίας των ποδοκυττάρων
Μέθοδοι: Σε ποντίκια Balb/c ηλικίας 2 μηνών χορηγήθηκαν 3 διαφορετικές δόσεις ραπαμυκίνης ενδοπεριτοναϊκά για 1 εβδομάδα (χαμηλή δόση ΧΔ: 1, ενδιάμεση δόση ΕΔ: 1.5, και υψηλή δόση ΥΔ: 3 mg/kg ΒΣ/ημέρα, 4 ποντίκια σε κάθε ομάδα – μοντέλο δόσης ΜΔ). Μια ενδιάμεση δόση ραπαμυκίνης (1.5mg/kg/ημέρα) χορηγήθηκε ενδοπεριτοναϊκά για 3 διαφορετικές περιόδους (σύντομη χορήγηση ΣυΧ: για 1 εβδομάδα, ενδιάμεση χορήγηση ΕνΧ: για 4 εβδομάδες και μακροχρόνια χορήγηση ΜαΧ: για 8 εβδομάδες, 4 ποντίκια σε κάθε ομάδα – μοντέλο χρόνου ΜΧ). Έξι ποντίκια έλαβαν μόνο το έκδοχο (DMSO) και χρησίμευσαν ως ομάδα ελέγχου (ΟΕ).
Η πρωτεΐνη ούρων 24ωρου και το σωματικό βάρος προσδιορίστηκαν στην αρχή της μελέτης και ανά εβδομάδα. Η αλβουμίνη ούρων 24ωρου στην αρχή και στο τέλος της μελέτης. Τα επίπεδα ραπαμυκίνης και κρεατινίνης στο αίμα προσδιορίστηκαν κατά τη θυσία. Η ιστολογία των νεφρών εξετάστηκε με φωτονικό (ΦΜ) και ηλεκτρονικό μικροσκόπιο (ΗΜ) και με ανοσοφθορισμό (ΑΦ) για τις πρωτεΐνες νεφρίνη και ποδοσίνη. Επίσης έγινε WB & RT-PCR για τη μέτρηση της πρωτεϊνικής και
γονιδιακής έκφρασης της νεφρίνης και ποδοσίνης. Τέλος η σπειραματική έκφραση της κινάσης Akt και η φωσφορυλίωσή της εξετάστηκαν με WB.
Αποτελέσματα: Όλα τα ζώα που έλαβαν θεραπεία παρουσίασαν μείωση της αποβολή ολικής πρωτεΐνης στα ούρα κατά τη διάρκεια της μελέτης, ενώ παρουσίασαν αύξηση της αλβουμινουρίας στατιστικά σημαντική για τις ομάδες ΥΔ και ΕνΧ. Η νεφρική λειτουργία και το σωματικό βάρος παρουσίασαν ελαφρά-μέτρια μείωση κυρίως στην ομάδα της ΥΔ (Κρεατινίνη ορού: 0.34±0.03 vs. 0.24±0.01 mg/dl στην ΟΕ, p<0.01). Στο ΗΜ παρατηρήσαμε μια αύξηση της μέσης τιμής του πάχους των ποδικών εκβλαστήσεων την 1η εβδομάδα (ΟΕ 335nm, ΧΔ 385nm, ΕΔ&ΣυΧ 420nm, ΥΔ 420nm), η οποία επιδεινώθηκε περαιτέρω την 4η εβδομάδα χορήγησης (ΕνΧ 456nm) και τελικά βελτιώθηκε την 8η εβδομάδα (ΜαΧ 401nm). Τα επίπεδα mRNA της νεφρίνης και ποδοσίνης παρουσίασαν σημαντική πτώση την 1η εβδομάδα (40-60% χαμηλότερα από την ΟΕ, όλα τα p<0.001), ανεξαρτήτως χορηγούμενης δόσης, στη συνέχεια την 4η εβδομάδα βελτιώθηκαν και επανήλθαν στο φυσιολογικό την 8η εβδομάδα. Τα επίπεδα των πρωτεϊνών νεφρίνης και ποδοσίνης παρουσίασαν οριακή πτώση την 4η εβδομάδα και αποκαταστάθηκαν πλήρως την 8η εβδομάδα, ενώ στον ανοσοφθορισμό εκφράστηκαν φυσιολογικά στην περιφέρεια των τριχοειδικών αγκυλών. Τα επίπεδα της ολικής Akt παρέμειναν σταθερά και στα 2 μοντέλα αλλά η φωσφορυλίωσή της στη θέση Ser473 αυξήθηκε μέτρια στην ομάδα της ΥΔ και σημαντικά στις ομάδες ΕνΧ και ΜαΧ (p<0.005)
Συμπεράσματα: Και στα δυο μοντέλα δόσης και χρόνου, παρατηρήσαμε σημαντικές μεταβολές στη νεφρική λειτουργία, στην αρχιτεκτονική των ποδοκυττάρων, στη μεταγραφή των πρωτεϊνών του λεπτού διαφράγματος και στη σπειραματική ενεργοποίηση της Akt. Οι μεταβολές αυτές παρατηρήθηκαν κυρίως στον πρώτο μήνα θεραπείας ενώ μακροπρόθεσμα βελτιώθηκαν σχεδόν πλήρως, υποδηλώνοντας πιθανά την ύπαρξη ενός φαινομένου «διαφυγής» από τη δράση της ραπαμυκίνης. Η αύξηση της φωσφορυλίωσης της Akt πιθανά σχετίζεται με μεταβολές της έκφρασης των πρωτεϊνών του λεπτού διαφράγματος ή την ενεργοποίηση κάποιας από τις κινάσες PDK2. Ωστόσο είναι άγνωστο αν η ενεργοποίηση της Akt συμμετέχει απλά στην παθογένεια των ιστολογικών μεταβολών των σπειραματικών κυττάρων και δη των ποδοκυττάρων ή αποτελεί αντιρροπιστικό μηχανισμό που συμβάλλει στην τελική αποκατάσταση της βλάβης.
2. Μελέτη της επίδρασης της ραπαμυκίνης στη δομή και λειτουργία των επιθηλιακών σπειραματικών κυττάρων σε ποντίκια με νεφρίτιδα του Λύκου
Εισαγωγή: O αναστολέας της mTOR ραπαμυκίνη έχει φανεί να αναστέλλει την εξέλιξη της νεφρίτιδας του Λύκου (ΝΛ) σε τρωκτικά, χάρη στις ισχυρές ανοσοκατασταλτικές της ιδιότητες. Το σηματοδοτικό μονοπάτι της κινάσης των φωσφοϊνοσιτιδίων/Akt (PI3K/Akt) αποτελεί τον κυριότερο υπερκείμενο ρυθμιστή της δραστηριότητας της mTOR και εμπλέκεται στην προαγωγή της νεοπλασίας και της αυτοανοσίας. Η δραστηριότητα του μονοπατιού PI3K/Akt/mTOR στη νεφρίτιδα του λύκου δεν έχει μελετηθεί μέχρι σήμερα.
Μέθοδοι: Σε NZBW/F1 θηλυκά ποντίκια, εξετάσαμε τη σπειραματική έκφραση των κινασών Akt και mTOR με ανοσοφθορισμό και western blot. Ελέγξαμε επίσης για συγκεκριμένες φωσφορυλιώσεις των κινασών αυτών που συμβαίνουν κατά την ενεργοποίηση του μονοπατιού PI3K/Akt/mTOR. Χορηγήθηκε ενδοπεριτοναϊκά ραπαμυκίνη για 4μήνες, ξεκινώντας είτε πριν (προληπτική ομάδα, PG) είτε μετά την ανάπτυξη παθολογικής πρωτεϊνουρίας (gt;20 mg/ημέρα, θεραπευτική ομάδα, TG). Ως ομάδες ελέγχου χρησιμοποιήθηκαν μη πρωτεϊνουρικά ποντίκια χωρίς θεραπεία (ομάδα υγειών μυών, HC) και πρωτεϊνουρικά ποντίκια με ΝΛ χωρίς θεραπεία (ομάδα λύκου, UG).
Αποτελέσματα: Βρήκαμε ότι στα μη θεραπευμένα ζώα, σε αντίθεση με τα υγιή, οι Akt και mTOR υπερεκφράζονται και είναι φωσφορυλιωμένες σε θέσεις κλειδιά για την ενεργοποίησή τους. Η ραπαμυκίνη παρατείνει την επιβίωση, διατηρεί φυσιολογική τη νεφρική λειτουργία, ομαλοποιεί την πρωτεϊνουρία, αποκαθιστά τα επίπεδα νεφρίνης και ποδοσίνης, μειώνει τους τίτλους των anti-dsDNA, προλαμβάνει ή εξαλείφει τις ιστολογικές βλάβες και περιορίζει την έκφραση και ενεργοποίηση των κινασών Akt and mTOR στα σπειράματα.
Συμπεράσματα: Τα ευρήματα αυτά δείχνουν ότι: 1) Η ενεργοποίηση του μονοπατιού PI3K/Akt/mTOR παίζει σημαντικό ρόλο στην παθογένεια της νεφρίτιδας του λύκου σε ποντίκια NZBW γεγονός που δικαιολογεί τη χορήγηση θεραπείας με ραπαμυκίνη. 2) Στη νεφρίτιδα του λύκου, η ραπαμυκίνη δεν σταματάει απλά την μεταφορά του σήματος στην κατωφέρεια της ενεργοποιημένης mTOR αλλά αναστέλλει την
ενεργοποίηση του μονοπατιού PI3K/Akt/mTOR στο σύνολο του 3) Η μονοθεραπεία με ραπαμυκίνη μπορεί να προλάβει πλήρως την εξέλιξη της νόσου εάν χορηγηθεί πρώιμα, αλλά και να αναστρέψει σε σημαντικό βαθμό τις εκδηλώσεις της ήδη εγκατεστημένης νόσου. Η μελέτη της δραστηριότητας του μονοπατιού PI3K/Akt/mTOR μπορεί να προσφέρει νέα δεδομένα και γνώση πάνω στην παθογένεια της νεφρίτιδας του λύκου στους ανθρώπους και να οδηγήσει σε πιο εξατομικευμένες και λιγότερο τοξικές θεραπείες της νόσου.
|
Αναζήτηση
