| Περίληψη |
Τα επιθήλια αποτελούν σημαντικές δομικές αλλά και λειτουργικές μονάδες πολυάριθμων ιστών. Συμμετέχουν στο σχηματισμό των περισσότερων, αν όχι όλων των οργάνων και είναι σημαντικά για τη αλληλεπίδραση τους με τους γειτονικούς ιστούς και το περιβάλλον. Εμπλέκονται σε διάφορες φυσιολογικές διεργασίες όπως την πρόσληψη θρεπτικών συστατικών και το φιλτράρισμα του αίματος. Παράλληλα, προστατεύουν τον οργανισμό από τη εισβολή εξωγενών παθογόνων και λειτουργούν ως φραγμοί διαπερατότητας περιορίζοντας την ελεύθερη διάχυση νερού και διαλυτών.
Το αναπνευστικό σύστημα των εντόμων αποτελείται από ένα περίπλοκο δίκτυο επιθηλιακών αγωγών (την τραχεία και τα αναπνευστικά στόμια) που μεταφέρουν οξυγόνο μέσω του αέρα σε όλα τα επιμέρους όργανα. Αναπτύσσεται κατά την εμβρυογένεση και γίνεται λειτουργικό κατά την εκκόλαψη της προνύμφης. Οι αεραγωγοί και τα αναπνευστικά στόμια της Drosophila melanogaster έχουν μελετηθεί εκτενώς καθώς αποτελούν αντιπροσωπευτικό μοντέλο για την κατανόηση της ανάπτυξης, της ωρίμανσης και της λειτουργίας των επιθηλιακών σωληνοειδών οργάνων.
Σε μια προσπάθεια εντοπισμού νέων γονιδίων που εμπλέκονται στην ανάπτυξη και την ωρίμανση του αναπνευστικού συστήματος της Drosophila και ειδικότερα στο σχηματισμό του φραγμού διαπερατότητας του τραχειακού επιθηλίου, πραγματοποιήθηκε γενετική διαλογή διαφόρων μεταλλαγμένων στελεχών. Η συγκεκριμένη προσέγγιση οδήγησε στην ταυτοποίηση του γονιδίου Btk29A ως σημαντικό για τη μορφογένεση των οπίσθιων αναπνευστικών στομίων, τη λειτουργία του τραχειακού φραγμού διαπερατότητας και την ωρίμανση του τραχειακού συστήματος. Το γονίδιο Btk29A κωδικοποιεί για μια κινάση τυροσίνης, της οικογένειας των Tec κινασών, η οποία είναι συντηρημένη τόσο στα σπονδυλωτά , όσο και στα ασπόνδυλα.
Στόχος της παρούσας μελέτης είναι η αποσαφήνιση του ρόλου του Btk29A στην ανάπτυξη του αναπνευστικού συστήματος της Drosophila.
Ανάλυση του προτύπου έκφρασης του γονιδίου Btk29A με πειράματα in situ υβριδοποίησης και ανοσοϊστοχημικές χρώσεις, με χρήση νέου πολυκλωνικού αντισώματος για την πρωτεΐνη Btk29A, που αναπτύχθηκε στο εργαστήριο στα πλαίσια της παρούσας μελέτης, αποκάλυψε πως το γονίδιο εκφράζεται στα κύτταρα του τραχειακού συστήματος και των οπίσθιων αναπνευστικών στομίων. Η έκφραση του Btk29A στους συγκεκριμένους ιστούς ξεκινά στο εμβρυικό στάδιο 11 και διατηρείται μέχρι και το τέλος της εμβρυογένεσης. Παράλληλα αποκαλύφθηκε πως μονάχα η μια από τις δυο ισομορφές της πρωτεΐνης Btk29A, η Τύπου 1 (ή Κοντή) ισομορφή, εκφράζεται από τα κύτταρα του αναπνευστικού συστήματος, ενώ η Τύπου 2 (ή Μακριά) ισομορφή εντοπίζεται μονάχα στα κύτταρα του κεντρικού νευρικού συστήματος.
1
Τα οπίσθια αναπνευστικά στόμια της Drosophila συνδέουν το τραχειακό σύστημα με το περιβάλλον. Αποτελούνται εσωτερικά από τον αναπνευστικό θάλαμο (spiracular chamber), ένα σωληνοειδή ιστό, συνεχή του τραχειακού σωλήνα, και εξωτερικά από το στιγματοφόρο (stigmatophore), μια εκτενή επιδερμική δομή που περιβάλλει τον αναπνευστικό θάλαμο. Ο ιστός αναπτύσσεται από μια ομάδα επιθηλιακών κυττάρων εκτοδερμικής προέλευσης μέσα από ποικίλες μορφογενετικές αλλαγές. Στο τέλος της εμβρυογένεσης, τα συγκεκριμένα κύτταρα ολοκληρώνουν τοπολογικές αναδιατάξεις σχηματίζοντας τα τρισδιάστατα οπίσθια αναπνευστικά στόμια. Τόσο τα κύτταρα του αναπνευστικού θαλάμου, όσο και τα κύτταρα του στιγματοφόρου εκφράζουν Btk29A. Σε ομόζυγα μεταλλαγμένα έμβρυα για το Btk29A, τα οπίσθια αναπνευστικά στόμια είναι κοντύτερα από αυτά των αγρίου τύπου εμβρύων και εμφανίζουν μη φυσιολογικό σχήμα.
Παρατήρηση της ανάπτυξης των οπίσθιων αναπνευστικών στομίων ζωντανών εμβρύων, με in vivo μικροσκοπία, αποκάλυψε πως τα κύτταρα του αναπνευστικού θαλάμου δεν ολοκληρώνουν τη διαδικασία εγκόλπωσης που είναι αναγκαία για τη μορφογένεσή του ιστού, με τα πιο οπίσθια αυτών να παραμένουν στην επιφάνεια. Για την καλύτερη ανάλυση του φαινοτύπου, εξετάσθηκαν παράμετροι που εμπλέκονται στη ρύθμιση της εγκόλπωσης των κυττάρων του αναπνευστικού θαλάμου, όπως: η διαδικασία σύσφιξης της κορυφαίας μεμβράνης (apical constriction), οι αλλαγές στο σχήμα των κυττάρων, η οργάνωση του κυτταροσκελετικού δικτύου της ακτίνης και της μυοσίνης και η ενεργότητα της Rho1 GTPase. Καμία από τις παραπάνω παραμέτρους δεν επηρεάζεται σε ομόζυγα μεταλλαγμένα έμβρυα για το Btk29A. Παράλληλα, πραγματοποιήθηκαν πειράματα διάσωσης φαινοτύπου βασισμένα στην ιστοειδική έκφραση του γονιδίου Btk29A με χρήση του συστήματος UAS-GAL4. Τα συγκεκριμένα πειράματα έδειξαν πως η επαναφορά της έκφρασης της Btk29A στα κύτταρα του αναπνευστικού θαλάμου δε διασώζει την ανώμαλη μορφογένεση των οπίσθιων αναπνευστικών στομίων. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός πως ο φαινότυπος διασώζεται με επαναφορά της έκφρασης της Btk29A στα κύτταρα του στιγματοφόρου. Τα παραπάνω αποτελέσματα προτείνουν πως η εγκόλπωση των κυττάρων του αναπνευστικού θαλάμου είναι πιθανό να ρυθμίζεται μέσω κυτταρικά μη αυτόνομης (non-cell autonomous) δράσης της Btk29A στα κύτταρα του στιγματοφόρου.
Παρατήρηση των μορφογενετικών κινήσεων των κυττάρων του στιγματοφόρου ζωντανών εμβρύων, με in vivo μικροσκοπία, αποκάλυψε πως η Btk29A είναι σημαντική για τις τοπολογικές ανακατατάξεις των κυττάρων του στιγματοφόρου. Επιπρόσθετα, αποκάλυψε πως η σωστή ρύθμιση αυτών των ανακατατάξεων είναι σημαντική για τη φυσιολογική τοποθέτηση των γειτονικών κυττάρων του αναπνευστικού θαλάμου και την ολοκλήρωση της εγκόλπωσης τους.
Συνολικά, η παρούσα μελέτη προτείνει πως η κινάση τυροσίνης Btk29A, της οποίας η έκφραση στα οπίσθια αναπνευστικά στόμια ρυθμίζεται από το μεταγραφικό παράγοντα Abdominal-B, επηρεάζει τη μορφογένεση του συγκεκριμένου ιστού με δύο διακριτούς τρόπους. Πρωτίστως, 2
ρυθμίζει τις τοπολογικές ανακατατάξεις των κυττάρων του στιγματοφόρου δρώντας κυτταρικά αυτόνομα (cell autonomously) στα κύτταρα αυτά. Δευτερευόντως, η Btk29A εξασφαλίζει, δρώντας κυτταρικά μη αυτόνομα (non-cell autonomously), την αποτελεσματική εγκόλπωση των κυττάρων του αναπνευστικού θαλάμου.
Πέραν του μη φυσιολογικού σχηματισμού των οπίσθιων αναπνευστικών στομίων, το αναπνευστικό σύστημα των ομόζυγα μεταλλαγμένων Btk29A στελεχών χαρακτηρίζεται και από διατάραξη του φραγμού διαπερατότητας του τραχειακού επιθηλίου και μη ολοκλήρωση της ωρίμανσης του κατά το τέλος της εμβρυογένεσης. Η συνολική μορφολογία της τραχείας δεν επηρεάζεται: οι αεραγωγοί εμφανίζουν φυσιολογικό μέγεθος, σχηματισμό των διακλαδώσεων και η χιτίνη εναποτίθεται φυσιολογικά στο εσωτερικό του τραχειακού αυλού. Για την κατανόηση της εμπλοκής της Btk29A στη διατάραξη του επιθηλιακού φραγμού διαπερατότητας της τραχείας εξετάσθηκε η δομή και η μοριακή σύσταση συγκεκριμένων διακυτταρικών συνδέσεων, των Διαφραγματικών Συνδέσεων (septate junctions, SJs), που είναι σημαντικές για το σχηματισμό και τη διατήρηση των επιθηλιακών φραγμών διαπερατότητας στη Drosophila. Ανάλυση των διαφραγματικών συνδέσεων που αναπτύσσονται μεταξύ των κυττάρων της τραχείας δεν αποκάλυψε ανωμαλία στη δομή και τον εντοπισμό των πρωτεϊνικών μορίων που τις συνιστούν. Κατά συνέπεια, η διατάραξη του επιθηλιακού φραγμού διαπερατότητας δεν είναι αποτέλεσμα μη φυσιολογικού σχηματισμού ή διατήρησης των Διαφραγματικών Συνδέσεων.
Συνοψίζοντας, η παρούσα μελέτη προσφέρει νέες πληροφορίες για τη δράση της κινάσης Btk29A στην ανάπτυξη και ωρίμανση του αναπνευστικού συστήματος της Drosophila melanogaster. Ειδικότερα, επισημαίνει τη σημασία των πολύπλοκων αλληλεπιδράσεων που αναπτύσσονται μεταξύ των οργάνων κατά τη μορφογένεση για τη σωστή ανάπτυξη και λειτουργία των οργάνων.
|
Αναζήτηση
