| Περίληψη |
Οι κύριοι ερευνητικοί στόχοι της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν να
απαντηθούν ερωτήματα που αφορούν στη διερεύνηση των μοριακών μηχανισμών που
ρυθμίζουν την έκφραση γονιδίων που συμμετέχουν στο μεταβολισμό των
λιποπρωτεϊνών στο ήπαρ και να τακτοποιηθούν νέες μοριακές στρατηγικές για την
αύξηση των επιπέδων της HDL στο πλάσμα.
Ο μεταβολισμός των λιποπρωτεϊνών περιλαμβάνει τη μεταφορά λιπιδίων,
ιδιαίτερα χοληστερόλης και τριγλυκεριδίων, από το έντερο και το ήπαρ προς τους
περιφερικούς ιστούς και αντίστροφα από τη περιφέρεια πίσω στο ήπαρ (αντίστροφη
μεταφορά χοληστερόλης). Στα μονοπάτια αυτά εμπλέκονται πολλές πρωτεΐνες,
συμπεριλαμβανομένων των απολιποπρωτεϊνών, μεμβρανικοί μεταφορείς, ένζυμα του
πλάσματος και υποδοχείς λιποπρωτεϊνών. Η λιποπρωτεινική λιπάση (LPL) παίζει
σημαντικό ρόλο στο μεταβολισμό των λιποπρωτεϊνών καθώς καταλύει την υδρόλυση
των τριγλυκεριδίων που βρίσκονται στα λιποπρωτεϊνικά σωματίδια πλούσια σε
τριγλυκερίδια, όπως είναι τα χυλομικρά και η VLDL (very low density lipoprotein).
Τα λιπαρά οξέα που ελευθερώνονται στους ιστούς αποθηκεύονται στο λιπώδη ιστό ή
χρησιμοποιούνται για παραγωγή ενέργειας από διάφορους ιστούς. Η LPL εκφράζεται
σε υψηλά επίπεδα κυρίως στο λιπώδη ιστό και τους μύες, αλλά ανιχνεύεται σε
χαμηλά επίπεδα σε άλλους ιστούς, συμπεριλαμβανομένου και του ήπατος. Ο ρόλος
της LPL στο ενήλικο ήπαρ είναι αμφιλεγόμενος εξαιτίας των χαμηλών επιπέδων
έκφρασης της σ αυτόν τον ιστό. Παρ’ όλα αυτά, πρόσφατες μελέτες σε μοντέλα
ποντικών στα οποία υπερκεράζεται ή απαλείφεται η LPL στο ήπαρ, έχουν αναδείξει
τη σημαντικότητα αυτού του ενζύμου στο μεταβολισμό των λιπιδίων και της
γλυκόζης.
Στην Ενότητα Ι, χαρακτηρίσαμε το μηχανισμό που ρυθμίζει την έκφραση του
γονιδίου LPL του ανθρώπου στα ηπατικά κύτταρα σε μεταγραφικό επίπεδο. Αρχικά
κλωνοποιήσαμε τον υποκινητή της ανθρώπινης LPL και πραγματοποιήσαμε ανάλυση
των απαλοιφών του υποκινητή της LPL με πειράματα παροδικής διαμόλυνσης
κυττάρων HepG2. Παρατηρήσαμε ότι η κοντινή περιοχή -109/-28 του υποκινητή
είναι σημαντική για τη βασική ηπατική ενεργότητα του υποκινητή του γονιδίου LPL.
Με βιοπληροφορική ανάλυση αυτής της περιοχής εντοπίστηκε μια πιθανή θέση
πρόσδεσης (-47/-40) για τον παράγοντα FOXA2 (HNF3β), ο οποίος παίζει σημαντικό
ρόλο στην ομοιόσταση των λιπιδίων και της γλυκόζης. Αποσιώπηση της έκφρασης της ενδογενούς πρωτεΐνης FOXA2 στα κύτταρα HepG2 (χρησιμοποιώντας ένα ειδικό
siRNA), οδήγησε σε μείωση των επιπέδων πρωτεΐνης και mRNA του γονιδίου LPL.
Πειράματα ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης και αλληλεπίδρασης DNA-πρωτεϊνών
έδειξαν ότι ο μεταγραφικός παράγοντας FOXA2 προσδένεται στην κοντινή περιοχή -
141/-10 του υποκινητή της LPL. Αυτό το ρυθμιστικό στοιχείο χαρακτηρίστηκε
περαιτέρω με μεταλλαξιγένεση. Μεταλλάξεις πέντε βάσεων στη θέσης πρόσδεσης
του FOXA2 (-47/-40) κατάργησαν την πρόσδεση του FOXA2 στη θέση αυτή και
μείωσαν σημαντικά τόσο τη βασική ενεργότητα του υποκινητή της LPL όσο και την
ενεργοποίηση του υποκινητή από τον παράγοντα FOXA2. Στη συνέχεια, μελετήσαμε
την επίδραση της ινσουλίνης στην ηπατική ρύθμιση του γονιδίου LPL στα κύτταρα
HepG2. Παρατηρήσαμε ότι η ινσουλίνη αύξησε τα επίπεδα φωσφορυλίωσης της
ΑΚΤ και οδήγησε σε αποκλεισμό του FOXA2 από τον πυρήνα, το οποίο στη
συνέχεια προκάλεσε μείωση των επιπέδων mRNA του γονιδίου LPL και της
ενεργότητας του υποκινητή. Με βάση αυτά τα ευρήματα, προτείνουμε ένα νέο ρόλο
του παράγοντα FOXA2 στη ρύθμιση του γονιδίου LPL του ανθρώπου από την
ινσουλίνη, στα ηπατικά κύτταρα.
Στην Ενότητα ΙΙ, διερευνήσαμε το μηχανισμό ρύθμισης του γονιδίου LPL
του ανθρώπου από τους πυρηνικούς υποδοχείς LXR (Liver X Receptors) στα ηπατικά
κύτταρα. Προηγούμενες μελέτες σε μοντέλα ποντικών είχαν δείξει ότι η έκφρασή του
γονιδίου LPL στο ήπαρ επάγεται ισχυρά από δίαιτες υψηλές σε χοληστερόλη ή από
συνθετικούς LXR αγωνιστές που ενεργοποιούν τους πυρηνικούς υποδοχείς LXR και
RXR (Retinoid X Receptor). Σε συμφωνία με αυτά τα ευρήματα, δείξαμε ότι επώαση
κυττάρων HepG2 ή πρωτογενών ηπατοκυττάρων ποντικού με τον συνθετικό LXR
αγωνιστή T0901317 αύξησαν την έκφραση του γονιδίου της LPL τόσο σε επίπεδό
RNA όσο και πρωτεϊνών. Επίσης η υπερέκφραση του ετεροδιμερούς LXRα/RXRα σε
κύτταρα HepG2 παρουσία των συνδετών τους, ενεργοποίησε ισχυρά τον υποκινητή -
883/+39 της ανθρώπινης LPL. ανάλυση των απαλοιφών του υποκινητή της LPL
έδειξαν ότι η ελάχιστη περιοχή που απαιτείται για την ενεργοποίηση από τα
ετεροδιμερή LXRα/RXRα ήταν η -109/-28, η οποία περιλαμβάνει τη θέση πρόσδεσης
του FOXA2. Ενδιαφέρον παρουσιάζει, το γεγονός ότι οι υποδοχείς LXRα και RXRα
προσδένονται πολύ ασθενικά στον υποκινητή του γονιδίου LPL, όπως διαπιστώθηκε
με πειράματα ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης, υποδεικνύοντας ότι επιπλέον
παράγοντες απαιτούνται για την δράση των LXR. Αποσιώπηση της έκφρασης της
ενδογενούς πρωτεΐνης FOXA2 στα κύτταρα HepG2 και σε πρωτογενή ηπατοκύτταρα ποντικού, χρησιμοποιώντας ένα ειδικό siRNA, προκάλεσε δραματική μείωση της
επαγωγής της έκφρασης του γονιδίου LPL από τον συνδέτη του LXR, T0901317, σε
επίπεδο πρωτεΐνης και mRNA. Αξιοσημείωτη είναι η διαπίστωση ότι η ινσουλίνη, η
οποία απενεργοποιεί τον παράγοντα FOXA2 μέσω πυρηνικού του αποκλεισμού,
μείωσε την επαγωγή της έκφρασης του γονιδίου LPL από τις οξυστερόλες,
υποδεικνύοντας της σημαντικότητα του παράγοντα FOXA2 στην ομοιόσταση των
λιπιδίων στο ήπαρ. Έπειτα, παρατηρήσαμε ότι η ταυτόχρονη υπερέκφραση της
πρωτεΐνης FOXA2 και των LXRα/RXRα, παρουσία των συνδετών τους,
ενεργοποίησε τον υποκινητή της LPL κατά έναν συνεργατικό τρόπο.
Καταστρέφοντας τη θέση πρόσδεσης του παράγοντα FOXA2 (με τις μεταλλάξεις
που αναφέρθηκαν παραπάνω), αναστάλθηκε σημαντικά η συνεργατική ενεργοποίηση
του υποκινητή της LPL από τους πυρηνικούς υποδοχείς LXRα/RXRα και τον
παράγοντα FOXA2.Τέλος, πραγματοποιήσαμε πειράματα συν-ανοσοκατακρήμνισης
και δοκιμασίες GST pull down και δείξαμε ότι οι μεταγραφικοί παράγοντες FOXA2
και LXR/RXR αλληλεπιδρούν φυσικά in vivo και in vitro. Μια εκτεταμένη DBD
(DNA binding domain) περιοχή του υποδοχέα LXRα απαιτείται για τη τις φυσικές
αλληλεπιδράσεις με τουλάχιστον μία από τις δύο περιοχές ενεργοποίησης
(transactivation domains) του FOXA2. Συνοψίζοντας, τα ευρήματα των Ενοτήτων Ι
και ΙΙ υποδεικνύουν ότι ή νέα θέση πρόσδεσης του παράγοντα FOXA2 στον
υποκινητή της LPL λειτουργεί σαν ένα νέο ρυθμιστικό στοιχείο LXRE, το οποίο
διευκολύνει την επαγωγή του γονιδίου LPL από τις οξυστερόλες μέσω του
παράγοντα FOXA2. Μέσω ενός σηματοδοτικού μονοπατιού ινσουλίνης- AKTFOXA2-
LPL η υπερέκφραση της LPL στο ήπαρ εμποδίζεται σε συνθήκες περίσσειας
χοληστερόλης, προστατεύοντας τον ιστό αυτό από τις τοξικές δράσεις της LPL.
Στην Ενότητα ΙΙΙ, εστιαστήκαμε στην ρύθμιση γονιδίων που συμμετέχουν στη
βιογένεση και αναδιαμόρφωση της HDL από τους μεταγραφικούς παράγοντες
FOXA2 και LXRs στα ηπατικά κύτταρα. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι σε
ποντίκια ετερόζυγα για τον παράγοντα FOXA2, τα επίπεδα της HDL στο πλάσμα
είναι μειωμένα. Με βιοπληροφορική ανάλυση, εντοπίστηκαν πιθανές θέσεις
πρόσδεσης για τον παράγοντα FOXA2 που βρίσκονται κοντά σε χαρακτηρισμένα
ρυθμιστικά στοιχεία LXRE, στους υποκινητές των γονιδίων ABCG1, LIPC και
CETP. Σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες, παρατηρήσαμε ότι η επώαση
κυττάρων HepG2 και πρωτογενών ηπατοκυττάρων ποντικού με τον συνθετικό LXR
αγωνιστή , T0901317, προκάλεσε ισχυρή επαγωγή της έκφρασης των γονιδίων ABCG1, ABCG5, ABCG8 και CETP, σε επίπεδο mRNA. Απενεργοποίηση του
παράγοντα FOXA2, μέσω siRNA αποσιώπησης είτε μέσω επίδρασης με ινσουλίνη σε
πρωτογενή ηπατοκύτταρα ποντικού ή σε κύτταρα HepG2, μείωσε τα βασικά επίπεδα
mRNA αλλά και την επαγωγή των ABCG5 και ABCG8 γονιδίων, από τον αγωνιστή
T0901317, υποδεικνύοντας ότι ο FOXA2 έχει σημαντικό ρόλο στην ενεργοποίηση
αυτών των μεταφορέων λιπιδίων από τους συνδέτες των πυρηνικούς υποδοχείς LXR.
Πραγματοποιώντας πειράματα παροδικής διαμόλυνσης σε κύτταρα HepG2
παρατηρήσαμε ότι η υπερέκφραση της πρωτεΐνης FOXA2 ή των υποδοχέων
LXRα/RXRα οδήγησε σε αύξηση της ενεργότητας των υποκινητών των γονιδίων
ABCG5 και ABCG8. Σε συμφωνία με αυτά τα αποτελέσματα, αποσιώπηση της
έκφρασης της ενδογενούς πρωτεΐνης LXRα ή LXRβ στα κύτταρα HepG2, μέσω
λεντιïών που εκφράζουν ειδικά shRNAs για κάθε ισομορφή των LXR, μείωσε τα
επιπέδων mRNA των γονιδίων ABCG5 και ABCG8. Επιπλέον, η ταυτόχρονη
υπερέκφραση των πρωτεϊνών FOXA2 και LXRα/RXRα, παρουσία των συνδετών
τους ενεργοποίησε κατά έναν συνεργατικό τρόπο τον υποκινητή του γονιδίου
ABCG8, αλλά όχι τον υποκινητή του γονιδίου ABCG5. Αντίθετα, ο FOXA2
ανέστειλε την επαγωγή του υποκινητή του γονιδίου ABCG5 από τους LXRs και τις
οξυστερόλες στα κύτταρα HepG2, υποδεικνύοντας την ύπαρξη απομακρυσμένων
ρυθμιστικών στοιχείων και μεταγραφικών παραγόντων, τα οποία ίσως συνδέονται με
λούπες του DNA και με αυτόν τον τρόπο ρυθμίζουν την έκφραση των γονιδίων
ABCG5 και ABCG8. Τα ευρήματα αυτά έρχονται σε συμφωνία με την συνεργατική
ενεργοποίηση του υποκινητή της LPL από τους πυρηνικούς υποδοχείς LXRα/RXRα
και τον παράγοντα FOXA2, όπως περιγράφηκε παραπάνω.
Η κατανόηση σε βάθος των μηχανισμών, με τους οποίους συνδέονται τα
μεταβολικά μονοπάτια λιπιδίων και γλυκόζης στο ήπαρ από παράγοντες όπως ο
FOXA2 είναι ιδιαίτερα σημαντική για την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών
στρατηγικών για την αύξηση των επιπέδων της HDL και την προστασία ασθενών με
μεταβολικές ασθένειες, όπως η καρδιαγγειακή νόσος, ο διαβήτης, οι δυσλιπιδαιμίες
και το μεταβολικό σύνδρομο.
|
Αναζήτηση
