| Περίληψη |
Η μαζική αλληλούχηση περιβαλλοντικού DNA (eDNA metabarcoding) είναι ένα νέο σχετικά, μοριακό εργαλείο, που μας επιτρέπει την ανίχνευση οργανισμών σε περιβαλλοντικά δείγματα. Πρόκειται για μια πολλά υποσχόμενη τεχνική, με εφαρμογές στην οικολογία, την βιολογία διατήρησης, στην ανίχνευση ξενικών ειδών, στη βιοπαρακολούθηση και πολλά άλλα πεδία. Στη Μεσόγειο μέχρι στιγμής, η μέθοδος του eDNA metabarcoding έχει αξιοποιηθεί κυρίως για πλαγκτονικές κοινότητες και λιγότερο για μελέτες ιχθυοπανίδας.
Κύριος σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η ανάπτυξη ενός αξιόπιστου πρωτόκολλου eDNA metabarcoding για τη μελέτη της βιοποικιλότητας των ιχθύων στα ολιγοτροφικά συστήματα της περιοχής της Ανατολικής Μεσογείου. Για το λόγο αυτό, η παρούσα μελέτη χωρίστηκε σε δύο μέρη: α) την βελτιστοποίηση της τεχνικής με δοκιμή σε ενυδρεία με γνωστή σύσταση ψαριών και β) την εκτίμηση της ετερογένειας της κατανομής του eDNA των ειδών ψαριών σε ένα οικοσύστημα, ώστε να επιλεγεί η βέλτιστη μέθοδος δειγματοληψίας.
Για την βελτιστοποίηση της μεθόδου, έγιναν δειγματοληψίες σε δύο δεξαμενές του Ενυδρείου Κρήτης και δοκιμάστηκαν διαφορετικά ζεύγη εκκινητών PCR (για τμήματα των γονιδίων 16S rRNA και 12S rRNA) για να ελεγχθεί η ικανότητά τους να ανιχνεύουν τα είδη ψαριών τόσο ποιοτικά όσο και ημιποσοτικά. Για την εκτίμηση της ετερογένειας της κατανομής του eDNA σε φυσικά οικοσυστήματα, πραγματοποιήθηκε δειγματοληψία σε παραλιακό οικοσύστημα με διαφορετικά ενδιαιτήματα (3 δείγματα ανά ενδιαίτημα: σκληρό υπόστρωμα, μαλακό υπόστρωμα, λιβάδια Ποσειδωνίας και μεσόνερα). Και στις δύο περιπτώσεις, τα δείγματα αναλύθηκαν με Αλληλούχηση Νέας Γενιάς (NGS – Next Generation Sequencing).
Όσον αφορά το πρώτο μέρος, η μέθοδος δούλεψε καλά και με τα δύο ζεύγη εκκινητών που δοκιμάστηκαν. Εντοπίστηκαν σχεδόν όλα τα είδη σε κάθε δεξαμενή, τα περισσότερα μπορούσαν να προσδιοριστούν μέχρι το επίπεδο του είδους, με τον δείκτη 16S να έχει μεγαλύτερη διακριτική ικανότητα. Ο δείκτης 12S, δεν έχει χρησιμοποιηθεί σε έρευνες metabarcoding της Μεσογείου και η κατασκευή μιας ολοκληρωμένης βάσης δεδομένων αναφοράς που να περιλαμβάνει τα Μεσογειακά είδη ιχθύων κρίνεται απαραίτητη , ώστε να μπορεί να γίνεται ασφαλής ταυτοποίηση των ειδών. Επίσης, υπήρξε κάποια συσχέτιση μεταξύ βιομάζας και σχετικής αφθονίας, όπως η τελευταία εκτιμήθηκε με τη μέθoδο eDNA metabarcoding.
Για το παραλιακό οικοσύστημα, αποτελέσματα πήραμε μόνο με τη χρήση του δείκτη 16S. Συνολικά, εντοπίστηκαν 69 τάξα, 55 από τα οποία ταυτοποιήθηκαν στο επίπεδο του είδους, ενώ σε κάθε δείγμα ανιχνεύθηκαν 13 έως 27 είδη. Τα δείγματα από τα λιβάδια Ποσειδωνίας και τα μεσόνερα έδειξαν μεγαλύτερη ετερογένεια σε σχέση με το μαλακό και το σκληρό υπόστρωμα, τα οποία αντιθέτως είχαν μικρή ετερογένεια μεταξύ των δειγμάτων τόσο εντός κάθε ενδαιτήματος όσο και μεταξύ των δύο. Με βάση αυτά τα αποτελέσματα, ένα βελτιωμένο πρωτόκολλο θα πρέπει να περιλαμβάνει μεγαλύτερο όγκο νερού που φιλτράρεται ανά δείγμα (αλλά πρέπει να ξεπεραστούν κάποιες τεχνικές δυσκολίες), αύξηση των τεχνικών επαναλήψεων (PCR) ανά δείγμα (τουλάχιστον 3) , καθώς και τουλάχιστον μία δειγματοληψία ανά ενδιαίτημα. Εν κατακλείδι, η μέθοδος φαίνεται να δουλεύει ικανοποιητικά, και με κάποιες μικρές βελτιώσεις, μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως αξιόπιστο εργαλείο για τη μελέτη της βιοποικιλότητας και τη βιοπαρακαλούθηση των ιχθυοκοινοτήτων στα ολιγοτροφικά οικοσυστήματα της Ανατολικής Μεσογείου.
|
Αναζήτηση
