| Περίληψη |
Το ογκοκατασταλτικό γονίδιο p53 είναι συχνά μεταλλαγμένο σε πολλούς ανθρώπινους καρκίνους. Παρόλα αυτά, η πλειοψηφία των αιματολογικών κακοηθειών φέρουν την αγρίου τύπου πρωτεΐνη ΤP53 (wt-TP53), η οποία όμως είναι απενεργοποιημένη. Η πρωτεΐνη MDM2 (HDM2 στους ανθρώπους) προσδένεται στη wt TP53, ρυθμίζοντας αρνητικά τη μεταφραστική δραστηριότητα και σταθερότητα της wt ΤP53. Η Νατλίνη-3α (N3a) παρεμποδίζει την αλληλεπίδραση μεταξύ της TP53 και της MDM2, με αποτέλεσμα να σταθεροποιεί και να ενεργοποιεί μη-γενοτοξικά το μονοπάτι της wt-TP53 στα λεμφωματικά κύτταρα, προκαλώντας αναστολή του κυτταρικού κύκλου, και τελικά απόπτωση στις περισσότερες των περιπτώσεων.
Η ανάλυση και απεικόνιση σημάτων με φασματοσκοπία Raman επιτρέπει την ανίχνευση των δονήσεων των χημικών δεσμών, την αναγνώριση των τεσσάρων δομικών λίθων των βιομορίων (αμινοξέα, λιπίδια, νουκλεϊκά οξέα, σάκχαρα) και τέλος την ανάλυση του μοριακού προφίλ των δειγμάτων, χωρίς την ανάγκη ετικετών σήμανσης ή επιλεκτικών ανιχνευτών στα βιομόρια, και κυρίως με μη-επεμβατικό τρόπο.
Η έρευνά μας είχε δύο κυρίαρχους στόχους:
α) Την ανάλυση και σύγκριση τριών διαφορετικών Hodgkin και μη-Hodgkin λεμφωματικών σειρών, πριν και μετά την χορήγηση Ν3a, η οποία επάγει την επανενεργοποίηση της wt-TP53, με τεχνικές της φασματοσκοπίας Raman.
β) Την ανίχνευση και παρατήρηση της Ν3a στα λεμφωματικά κύτταρα, ώστε να ακολουθήσουμε την ενδοκυτταρική της πορεία και να εντοπίσουμε χωρικά την ενδοκυτταρική της δράση. Επιπλέον, η ανάλυσή μας επέτρεψε να εντοπίσουμε πιθανές δυσκολίες εισαγωγής της Ν3a στο κύτταρο.
Έπειτα από τη δοκιμή και βελτιστοποίηση διαφορετικών πειραματικών προσεγγίσεων, κυρίως στο κομμάτι της προετοιμασίας του δείγματος και στην ανάλυσή του, αναπτύξαμε μία πειραματική μεθοδολογία με ικανοποιητικά αποτελέσματα. Συνοπτικά, κυτταρικό εναιώρημα από τους διαφορετικούς τύπους λεμφώματος, σε συγκεκριμένη φάση της ανάπτυξής τους πριν και μετά την επίδραση με Ν3a, τοποθετήθηκε απευθείας επάνω σε αντικειμενοφόρο πλάκα μικροσκοπίου από CaF2, για απεικόνιση με Raman σε διαφορετικές θερμοκρασίες και συνθήκες εστίασης. Οι παρατηρήσεις των κυττάρων πραγματοποιήθηκαν με έναν καταδυτικό φακό Olympus 60x, ο οποίος είχε άμεση επαφή με το δείγμα.
Με τη φασματοσκοπία Raman καταφέραμε να εντοπίσουμε διακριτά σήματα-«αποτύπωμα», τα οποία μπορούσαν να διαφοροποιήσουν μεταξύ τους τα δύο κυτταρικά μοντέλα που χρησιμοποιήσαμε, λαμβάνοντας σήματα από τρεις ενδοκυτταρικές περιοχές (πυρήνας, μεμβράνη, κυτταρόπλασμα) και μία εξωκυτταρική, σε διαφορετικές θερμοκρασίες. Παρόλα αυτά, η σύγκριση των δύο κυτταρικών μοντέλων στηρίχθηκε σε σήματα Raman κυττάρων που λάβαμε από την περιοχή του πυρήνα, καθώς οι αντίστοιχες μετρήσεις είχαν μεγαλύτερη επαναληψιμότητα σε σχέση με αυτές του κυτταροπλάσματος και των μεμβρανών. Με την PCA ανάλυση καταφέραμε να επιβεβαιώσουμε τη διαφοροποίηση των δύο κυτταρικών μοντέλων. Επιπλέον, με τη φασματοσκοπία και ανάλυση Raman κατορθώσαμε να προσδιορίσουμε κορυφές ταυτοποίησης της Ν3a στα 480-481 cm-1 και 2436-2438 cm-1, οι οποίες δεν ανιχνεύονται σε άλλα βιολογικά μόρια. Αυτές χρησιμοποιήθηκαν για να παρακολουθήσουμε την πορεία και για τον εντοπισμό της Ν3a ενδοκυτταρικά και εξωκυτταρικά. Τα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι σε μη ζωντανά κύτταρα η Ν3a βρίσκεται εντός και εκτός των κυττάρων σε αντίθεση με τα ζωντανά κύτταρα όπου η N3a δεν εντοπίστηκε εντός αλλά μόνο εκτός των κυττάρων. Η φασματοσκοπία Raman αποτελεί μια πιθανή πολλά υποσχόμενη, γρήγορη και μη επεμβατική στρατηγική, για έγκαιρη, ακριβή διάγνωση, κατηγοριοποίηση και αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας των φαρμάκων.
|
Αναζήτηση
