| Περίληψη |
Τα κυτοχρώματα P450 (CYPs) ή μονοοξυγενάσες P450 ανήκουν στην υπεροικογένεια των μονοοξυγενασών που διαθέτουν αίμη b και εμπλέκονται στην οξείδωση μιας ποικιλίας οργανικών ενώσεων, όπως ξενοβιοτικά, αντιβιοτικά, στεροειδή, λιπαρά οξέα και άλλα. Σε μια τυπική αντίδραση που καταλύεται από κυτοχρώματα Ρ450, σχηματίζονται μέσω υδροξυλίωσης, μια αλκοόλη και νερό, με ταυτόχρονη οξείδωση του φωσφορικού νικοτινάμιδο-αδένινο νουκλεοτιδίου (NADPH). Το NADPH δρα ως δότης ηλεκτρονίων μέσω οξειδοαναγωγικών συστημάτων πρωτεινών, για την υδροξυλίωση του στόχευμένου υποστρώματος, αλλά η πολυπλοκότητα αυτών των συστημάτων περιορίζει την ευρύτερη εφαρμογή τους. Σκοπός της παρούσας διατριβής είναι η δημιουργία μιας συλλογής οξειδοαναγωγικών βιοκαταλυτών, ικανών να συνθέτουν βιοδραστικές ενώσεις. Το έργο χωρίζεται σε δύο μέρη.
Στο πρώτο μέρος, μετά από βιοπληροφορική ανάλυση αλληλούχισης προηγούμενων ερευνητών, ένας κατάλογος είκοσι διαφορετικών υποψηφίων CYPs μελετήθηκε αρχικά για τη συν-έκφραση με διαφορετικά οξειδοαναγωγικά συστήματα και έπειτα για την επιλεκτική υδροξυλίωση ενός στερεοειδόυς ενδιαφέροντος. Η αντίδραση πραγματοποιήθηκε σε συστήματα ολόκληρων κυττάρων, χρησιμοποιώντας στελέχη Ε. coli ως ξενιστές. Οι μελέτες αποσκοπούσαν στην επιτυχή πρωτεινική έκφραση με σωστή πρωτεινική αναδίπλωση και υδροξυλίωση του υποστρώματος με την εύρεση του κατάλληλου οξειδοαναγωγικού συστήματος. Ο έλεγχος της έκφρασης πραγματοποιήθηκε με ηλεκτροφόρηση πολυακρυλαμιδίου υπό αποδιατακτικες συνθήκες, η αναδίπλωση πρωτεΐνης υποδείχθηκε μετά από μελέτη κορεσμού των κυτοχρωμάτων με CO και ο σχηματισμός προϊόντος μελετήθηκε χρησιμοποιώντας χρωματογραφικές μεθόδους διαχωρισμού. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι παρόλου που αρκετά από τα CYPs ήταν σωστά αναδιπλωμένα, μόνο το OleP υδροξυλίωνε το στερεοειδές ενδιαφέροντος.
Χρησιμοποιώντας το OleP ως την καταλληλότερη μονοοξυγενάση, πραγματοποιήθηκαν αντιδράσεις με άλλα στερεοειδή υποστρώματα, όπως το χολικό οξύ και το δεοξυχολικό οξύ. Από τις βιομετατροπές σε ολόκληρα κύτταρα, αλλά και με καθαρισμένες πρωτεΐνες, μπόρεσε να αποδειχθεί ότι το OleP μπορεί να υδροξυλιώσει το δεόξυχολικό οξύ αλλά όχι το χολικό οξύ, τόσο με το σύστημα PdR/PdX, όσο και με το BMR.
Με βιοπληροφορική ανάλυση μελετήθηκε η εκλεκτικότητα των CYPs ως προς τα υποστρώματα ενδιαφέροντος. Η ανάλυση αυτή αυτή δεν μπόρεσε να αναδείξει το λόγο της εκλεκτικότητας του OleP προς το δεοξυχολικό οξύ, ενώ ήταν ανενεργό με το χολικό
οξύ. Παρόλα αυτά, μπόρεσε να προβλέψει την σωστή πρόσδεση του δεοξυχολικού οξέος, ενώ μέσω της ανάλυσης επιλέχθηκαν κάποιες θέσεις για πειράματα μεταλλαξιγένεσης, που θα μπορούσαν δυνητικά να οδηγήσουν σε διαφορετική τοποεκλεκτικότητα.
Στο δεύτερο μέρος μελετήθηκε η ανάπτυξη και η βελτιστοποίηση πρωτοκόλλων έκφρασης με σκοπό τη μεγιστοποίηση της παραγωγής συντηγμένων κυτοχρωμάτων με μοριακό βάρος ~ 120 kDa σε σωστά αναδιπλωμένη μορφή. Το μεγάλο μοριακό βάρος αποτελεί πρόκληση για την πρωτεινική έκφραση και σταθερότητα σε βακτηριακά συτήματα. Μετά την επιτυχή έκφραση και καθαρισμό των συντηγμένων κυτοχρωμάτων σε σωστά αναδιπλωμένη μορφή, ακολούθησε φωτομετρική ανάλυση αντιδράσεων με τα δύο εναντιομερή του λιμονενίου ως υποστρώματα. Η βιβλιογραφία επιβεβαιώθηκε για το (R)-λιμονένιο καθώς παρατηρήθηκε κατανάλωση NADPH, υποδεικνύοντας τη μετατροπή υποστρώματος. Παρόλα αυτά υπήρχαν και αναφορές για ενεργότητα ως προς το (S)-λιμονένιο, οι οποίες δεν επιβεβαιώθηκαν. Τα κυτοχρώματα που ταυτοποιήθηκαν στην παρούσα εργασία και εκφράστηκαν σε σωστά αναδιπλωμένη μορφή μπορούν να μελετηθούν περαιτέρω στο μέλλον όσον αφορά το φάσμα των υποστρωμάτων που υποδέχονται, ώστε να οδηγήσουν σε περισσότερα προϊόντα πιθανού βιοτεχνολογικού ενδιαφέροντος.
|
Αναζήτηση
