| Περίληψη |
Η γλουταμική αφυδρογονάση (GDH), ένα ένζυμο με σημαίνοντα ρόλο στο
μεταβολισμό του γλουταμικού, θεωρείται πως εντοπίζεται στα μιτοχόνδρια, μολονότι
νεότερες μελέτες έδειξαν εντόπιση ισομορφής της GDH στο ενδοπλασματικό δίκτυο,
στα λυσοσώματα, σε κυτταροπλασματικές μεμβράνες/κυστίδια ή ακόμη και στον
πυρήνα. Στον άνθρωπο υπάρχει σε δύο ισομορφές. Η πρώτη (hGDH1) κωδικοποιείται
από το γονίδιο GLUD1, το οποίο εκφράζεται σε όλους τους ιστούς (house-keeping),
περιέχει 13 εξόνια και χαρτογραφείται στο ανθρώπινο χρωμόσωμα 10. Η δεύτερη
(hGDH2) κωδικοποιείται από ένα φυλοσύνδετο μη περιέχων ιντρόνια γονίδιο
(GLUD2), το οποίο εκφράζεται ειδικώς στο νευρικό σύστημα και στους όρχεις. Η
wild type hGDH1είναι θερμοανθεκτική και έχει σημαντική βασική δραστηριότητα
(40-45% της μεγίστης) απουσία αλλοστερικών τροποποιητών. Αναστέλλεται όμως
ισχυρά από το GTP σε σχετικά χαμηλές συγκεντρώσεις GTP (IC50 = 0,3 μΜ),
ανάλογες αυτών που υπάρχουν υπό φυσιολογικές συνθήκες στους μη νευρικούς
ιστούς, καθιστώντας το GTP ρυθμιστή της δραστικότητας της GDH στους
περιφερικούς ιστούς. Η wild type hGDH2 είναι θερμοασταθής, εμφανίζει χαμηλή
βασική δραστηριότητα (5-10 % της μεγίστης) και δεν αναστέλλεται από το GTP, του
οποίου τα επίπεδα στο νευρικό ιστό είναι υψηλότερα. Ενεργοποιείται πλήρως σε
αυξημένες συγκεντρώσεις ADP και ως εκ τούτου λειτουργεί κυρίως όταν υπάρχει
αυξημένη κατανάλωση κυτταρικής ενέργειας (υψηλά επίπεδα ADP), όπως επί
έντονης διεγερτικής νευροδιαβίβασης. Επίσης η λευκίνη δρα ως αλλοστερικός
ενεργοποιητής σε μεγαλύτερο ποσοστό της wild type hGDH2 απ’ ότι της wild type
hGDH1, γεγονός που γίνεται εντονότερο παρουσία μικρών συγκεντρώσεων ADP
(συνέργεια ADP και λευκίνης). Οι διαφορές των δύο ισοενζύμων μελετήθηκαν με μ
μεταλλαξιογένεση σε θέσεις στις οποίες διαφέρουν και βρέθηκε πως δύο
αντικαταστάσεις αμινοξέων ευθύνονται για τις σημαντικότερες διαφορές μεταξύ των
wild type hGDH1 και wild type hGDH2. Η αντικατάσταση της Gly 456 από Ala
προσδίδει την ανθεκτικότητα στο GTP. Η δεύτερη αντικατάσταση (Arg443 από Ser)
ελαχιστοποιεί την βασική δραστικότητα (~3% της μεγίστης) αλλά επιτρέπει την
πλήρη ενεργοποίηση του ενζύμου με ADP και επιπλέον αποτρέπει την ενεργοποίηση
από τη λευκίνη. Παρουσία όμως μικρών συγκεντρώσεων ADP (0.025-0.1 mM) στις
οποίες μόνο του το ADP ελάχιστα ενεργοποιεί το ένζυμο (<10 % της μεγίστης
δραστηριότητας), παρατηρείται αύξηση της δραστηριότητας έως και >2,000 %. Τέλος
η Arg443 φαίνεται πως είναι υπεύθυνη για την ευαισθησία στη θερμική
αδρανοποίηση της wild type hGDH2. Η Arg443 βρίσκεται στην μικρή έλικα της
κατερχόμενης αλυσίδας της antenna και συνδέεται με δεσμούς υδρογόνου με τη Ser
409 της ανερχόμενης α-έλικας της antenna γειτονικής υπομονάδας.
Με σκοπό να εμβαθύνουμε περαιτέρω στον τρόπο ρύθμισης της wild type
hGDH2 δημιουργήσαμε αρχικώς 2 μεταλλαγμένες ισομορφές με αντικατάσταση της
Ser409 με Arg ή Asp. H Ser409Arg μεταλλαγμένη hGDH1 εμφάνισε πολύ χαμηλή
βασική ειδική δραστηριότητα (2.7 % της μεγίστης), παρουσίαζε σημαντική
ανθεκτικότητα στη δράση του ADP (SC50 =127.5±4.1 μM) και ήταν ανθεκτική στην
ενεργοποίηση από λευκίνη απουσία ADP. Μολαταύτα η παρουσία χαμηλών
συγκεντρώσεων ADP (25-100μΜ) ευαισθητοποιούσε το μεταλλαγμένο ένζυμο στη
δράση της λευκίνης (συνεργική δράση ADP-λευκίνης). Υιοθετούσε δηλαδή την
συμπεριφορά της μεταλλαγμένης Arg443Ser hGDH1 και προσομοιάζει στον τρόπο
ενεργοποίησης της hGDH2. Μολαταύτα ήταν απρόσμενα ανθεκτική στη θερμική
αδρανοποίηση (χρόνος ημίσειας ζωής = 239.7 min) και σημαντικά πιο ευαίσθητη σε
σύγκριση με την wild type hGDH1 (αλλά και την Arg443Ser μεταλλαγμένη hGDH1)
στην αναστολή από το GTP. Η Ser409Asp μεταλλαγμένη hGDH1 εμφάνιζε χαμηλή
βασική δραστηριότητα (3-5 % της μεγίστης) και σημαντικά μικρότερη ανθεκτικότητα
στην ενεργοποίηση από λευκίνη, ενώ διαπιστώνεται συνέργεια μεταξύ ADP και L-
λευκίνης μόνο σε χαμηλές συγκεντρώσεις ADP. Ενεργοποιούνταν από το ADP με
τρόπο ομοιάζοντα περισσότερο στη wild-type hGDH1 και εμφάνιζε ανθεκτικότητα
στην αναστολή από το GTP προσεγγίζοντας τη συμπεριφορά της wild-type hGDH2.
Τα ανωτέρω αποτελέσματα επιβεβαιώνουν πως η βασική αιτία της χαμηλής βασικής
δραστηριότητας της wild-type hGDH2 οφείλεται στην αλληλεπίδραση της Arg443
μίας υπομονάδος με την Ser409 γειτονικής υπομονάδας μέσω δεσμών Η, που
αποτελεί το κριτικό γεγονός για το άνοιγμα/κλείσιμο της καταλυτικής σχισμής.
Επιπλέον επιβεβαιώνεται πως η λευκίνη συνδέεται εντός του ενεργού κέντρου και
συνεπώς απαραίτητη συνθήκη για τη δράση της αποτελεί η διάνοιξη της καταλυτικής
σχισμής, γεγονός που επιτελείται με την αλληλεπίδραση Arg443 και Ser409.
Η διπλά μεταλλαγμένη R443S/G456A hGDH1 που κατασκευάσαμε
αναπαρήγαγε τις διαφορές που παρατηρούνται μεταξύ hGDH1 και hGDH2.
Συγκεκριμένα εμφάνισε χαμηλή βασική δραστηριότητα (0.25% της μεγίστης), ήταν
ευαίσθητη στη θερμότητα με χρόνο ημίσειας ζωής = 16.5 minutes, ήταν ~3 φορές πιο
ανθεκτική στην ενεργοποίηση από το ADP σε σχέση με την wild type hGDH2 και
επέδειξε παρόμοια με την wild type hGDH2 συμπεριφορά στην ανθεκτικότητα
αναστολής από το GTP παρουσία ADP, ενώ απουσία αλλοστερικού ενεργοποιητή
ήταν 8 φορές ανθεκτικότερη στη δράση του. Συνοπτικά υιοθετούσε συμπεριφορά
ενδιάμεση της Arg443Ser μεταλλαγμένης hGDH1 και της hGDH2 και παρότι η διπλά
μεταλλαγμένη R443S/G456A hGDH1 αποτελεί την καλύτερη έως σήμερα
προσομοίωση της wild-type hGDH2 δεν ταυτίζεται με αυτήν.
Τέλος μελετήσαμε την υποκυτταρική εντόπιση της γλουταμικής
αφυδρογονάσης με παροδική συν-διαμόλυνση των κυτταρικών σειρών COS 7, HeLa,
CHO, HEK 293 και SH-SY5Y (κυττάρων νευροβλαστώματος) με το χιμαιρικό
πλασμίδιο pEGFP-N3-GLUD1 (ή GLUD2) και με 3 πλασμιδιακούς φορείς τους
pDsRed2-Μitο, pDsRed2-Nuc και pDsRed2-ER -δείκτες υποκυτταρικής εντόπισης για
συγκεκριμένα κυτταρικά οργανύλλια (μιτοχόνδρια, πυρήνας και ενδοπλασματικό
δίκτυο αντιστοίχως). Σε όλες τις κυτταρικές σειρές που εξετάστηκαν και οι δύο
ισομορφές hGDH1 και hGDH2 εντοπίζονται κατά κύριο λόγο στα μιτοχόνδρια. Σε
μικρότερο ποσοστό εντοπιζόταν στο ενδοπλασματικό δίκτυο ανθρώπινων σωματικών
και νευρικών κυττάρων, ενώ δεν υφίσταται πυρηνική μορφή GDH.
|
Αναζήτηση
