| Περίληψη |
Tο οστεοσάρκωμα είναι ο πιο κοινός όγκος των οστών στα παιδιά και τους εφήβους. Το κύριο χαρακτηριστικό του οστεοσαρκώματος είναι ο κακοήθης μετασχηματισμός των οστεοβλαστικών κυττάρων και η συσσώρευση άφθονης, ημιτελώς ασβεστοποιημένης, εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας (ECM). Το άφθονο περιεχόμενο της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας αλλάζει το μικροπεριβάλλον των οστών και έχει επιπτώσεις στην κανονική λειτουργία των οστεοβλαστικών κυττάρων και στη διαφοροποίηση των κακοήθων κυττάρων.
Oι πρωτεογλυκάνες (PGs) είναι μια απο τις κύριες τάξεις μακρομορίων της κυτταρικής μεμβράνης και του εξωκυττάριου χώρου. Περιέχουν ένα πρωτεϊνικό κορμό με τον οποίο εíναι συνδεδεμένες ομοιοπολικά μια ή περισσότερες θειωμένες αλυσíδες γλυκοζαμινογλυκανών (GAGs). Οι αλυσίδες των GAGs είναι γραμμικά πολυμερή αποτελούμενα από επαναλαμβανόμενες δισακχαριδικές μονάδες που περιέχουν μια εξωζαμίνη και ένα ουρονικό οξύ ή γαλακτόζη στην περίπτωση της θειϊκής κερατάνης. Oι ιδιαίτερες φυσικοχημικές ιδιότητες των PGs τις καθιστούν ρυθμιστές της οργάνωσης του εξωκυττάριου χώρου, ενώ συμμετέχουν στη ρύθμιση πληθώρας κυτταρικών γεγονότων, όπως η κυτταρική προσκόλληση, η μετακίνηση, η διαφοροποίηση και ο πολλαπλασιασμός τους. Η ρυθμιστική δράση των PGs πραγματοποιείται μέσω των αλληλεπιδράσεων τους με δραστικά μακρομόρια του εξωκυττάριου χώρου καθώς και με αυξητικούς παράγοντες, είτε μέσω των γλυκανικών αλυσίδων τους είτε μέσω του πρωτεϊνικού τους κορμού.
Oι πρωτεογλυκάνες είναι σημαντικά συστατικά των μή κολλαγονοδών μακρομορίων του οστού. Συντίθενται και εκκρίνονται από τους οστεοβλάστες, και συμμετέχουν στον έλεγχο της ασβεστοποίησης των οστών. Επιπλέον, υπάρχουν ενδείξεις ότι οι PGs της κυτταρικής μεμβράνης (κυρίως η θειϊκή ηπαράνη) όπως και οι εκκρινόμενες PGs συμμετέχουν στην αλληλεπίδραση κύτταρο με κύτταρο και κύτταρο με εξωκυττάρια θεμέλια ουσία και μπορούν να παίζουν σημαντικό ρόλο στο σχηματισμό και την διατήρηση του οστίτη ιστού.
Τα φυσικοχημικά στοιχεία και οι μοριακές αλλαγές της εξωκυττάριας ουσίας του οστεοσαρκώματος, όπως και οι συσχετίσεις αυτών των αλλαγών με την διαφοροποίηση και την πρόγνωση του οστεοσαρκώματος δεν έχουν μελετηθεί επαρκώς. Ο ρόλος των πρωτεογλυκανών στους μηχανισμούς ανάπτυξης του οστεοσαρκώματος θεωρείται σημαντικός. Η λεπτομερής δομική ανάλυση των
υδατανθρακικών αλυσίδων των PGs θα φωτίσει τη βιοχημεία των γλυκοσυζευγμάτων που έχει εξαιρετικό ενδιαφέρον γιατί οι γλυκάνες συμμετέχουν στη ρύθμιση πληθώρας κυτταρικών γεγονότων, καθώς και στην κακοήθη εξαλλαγή των κυττάρων. Ο στόχος της μελέτης αυτής ήταν να συμβάλλει στην κατανόηση του ρόλου συγκεκριμένων PGs/ GAGs στη παθοφυσιολογία του οστεοσαρκώματος, ενός εκ των σημαντικότερων καρκίνων των οστών του ανθρώπου.
Χρησιμοποιήσαμε τις MG-63 και Saos 2 κυτταρικές σειρές ανθρώπινου οστεοσαρκώματος, υψηλού και χαμηλού μεταστατικού δυναμικού αντίστοιχα. Αυτές οι κυτταρικές σειρές διαφέρουν μεταξύ τους στο βαθμό διαφοροποίησης, η μια είναι μέτρια και η άλλη καλά διαφοροποιημένη. Σε κυτταρικές καλλιέργειες αυτών των σειρών, μελετήσαμε τη σύνθεση και τη κατανομή των GAGs τόσο στο υλικό καλλιέργειας όσο και την κυτταρική μεμβράνη. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι αμφότερες οι κυτταρικές σειρές συνθέτουν εξωκυττάριο υαλουρονικό οξύ (HA) καθώς και εκκρινόμενες και κυτταρικά προσκολλημένες γαλακτοζαμινογλυκάνες (GalAGs) και θειϊκή ηπαράνη (HS). Αν και αμφότερες οι κυτταρικές σειρές συνθέτουν αξιοσημείωτες ποσότητες PGs, τα Saos 2 κύτταρα παράγουν HA, GalAGs και HS σε σημαντικά χαμηλότερες ποσότητες από αυτές των MG-63 κυττάρων.
Μελετήσαμε επίσης τη δράση της γενιστεϊνης στη σύνθεση αυτών των μορίων. Ο μηχανισμός δράσης της γενιστεϊνης, μέσω της ειδικής αναστολής της πρωτεϊνης της κινάσης της τυροσίνης (PTK), στο πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων είναι γνωστός. Η ανασταλτική επίδραση της γενιστεϊνης στη σύνθεση των εξωκυττάρια εκκρινόμενων και των κυτταρικά προσκολλημένων GAGs/PGs στα Saos 2 κύτταρα βρέθηκε να είναι δοσοεξαρτώμενη, και πιο πιθανόν μέσω ενός PTK μηχανισμού. Η σύνθεση των GAGs/PGs από τα MG-63 κύτταρα με την παρουσία της γενιστεϊνης εξαρτάται από το τύπο και την κατανομή, υποδηλώνοντας ένα πιο σύνθετο μηχανισμό που ρυθμίζει την σύνθεση των PGs.
Έχει βρεθεί ότι οι GFs όπως, ο αυξητικός παράγοντας του μετασχηματισμού (TGF-β), ο βασικός αυξητικός παράγοντας των ινοβλαστών (bFGF) και ο αυξητικός παράγοντας των αιμοπεταλίων (PDGF) βοηθούν την ανάπτυξη του οστεοσαρκώματος. Έτσι, θελήσαμε να εξετάσουμε την δράση του TGF-β2, του bFGF και του PDGF-BB στη σύνθεση και κατανομή των GAGs/PGs στις δύο κυτταρικές σειρές οστεοσαρκώματος. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η δράση των αυξητικών
παραγόντων διαφέρει μεταξύ των δύο κυτταρικών σειρών και ότι η ρύθμιση στη σύνθεση των GAGs εξαρτάται από τον τύπο και την κατανομή τους.
Τροποποιήσεις της δομικής σύστασης των συστατικών των GAGs/PGs της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας μπορεί να έχει σημαντικές συνέπειες στο πολλαπλασιασμό των κυττάρων ή / και τη διαφοροποίηση τους. Σε οστεοβλάστες ανθρώπου, καθώς και στις MG-63 και Saos 2 κυτταρικές σειρές οστεοσαρκώματος, χορηγήσαμε στη συνέχεια τους κυριώτερους τύπους αλυσίδων GAGs π.χ τη θειϊκή χονδροϊτίνη (CSA), θειϊκή δερματάνη (DS) και ηπαρίνη (Hep) και μελετήσαμε την επίδρασή τους στην ανάπτυξη αυτών των κυττάρων. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι οι GAGs της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας είναι μακρομόρια που επηρεάζουν τη κυτταρική ανάπτυξη των κακοήθων και των φυσιολογικών κυττάρων οστεοβλαστικής αρχής με μια δοσοεξαρτώμενη συμπεριφορά. Αυτή η επίδραση σχετίζεται στενά με τη λεπτομερή χημική δομή των GAGs, όπως για π.χ. είναι η παρουσία L-ιδουρονικού οξέος και ο βαθμός της θείωσής τους.
Η βερσικάνη (versican), μια μεγάλου μεγέθους πρωτεογλυκάνη θειϊκής χονδροϊτίνης και το συνδεδεμένο σε αυτή HA είναι συστατικά της ECM που παίζουν ουσιαστικό ρόλο στην συμπεριφορά των μετασχηματισμένων κυττάρων. Η έκφραση συγκεκριμένων ισομορφών της βερσικάνης έχει ενοχοποιηθεί για την μετανάστευση και τον πολλαπλασιασμό καρκινικών κυττάρων. Επίσης η διακοπή της σύνθεσης HA μέσω της αναστολής της έκφρασης της συνθάσης 2 (HAS2) στα κύτταρα οστεοσαρκώματος καταστέλλει τον πολλαπλασιασμό, την κινητικότητα και την διηθητική ικανότητά τους. Επιπρόσθετα, λαμβάνοντας υπ’ όψην ότι ο TGF-β2, ο bFGF και ο PDGF-BB είναι σημαντικοί ρυθμιστές της έκφρασης των μακρομορίων της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας, μελετήσαμε την επίδραση αυτών των αυξητικών παραγόντων στην έκφραση των διαφόρων ισομορφών της βερσικάνης, στην σύνθεση της συνθάσης του ΗΑ από τα MG-63 κύτταρα του οστεοσαρκώματος αλλά και από φυσιολογικούς ανθρώπινους οστεοβλάστες του περιοδοντικού συνδέσμου (hPDL). Τα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι ο TGF-β2 προκαλεί την έκφραση της βερσικάνης και του HA από τα κύτταρα του ανθρώπινου οστεοσαρκώματος ενώ ο PDGF-BB είχε την κύρια επίδραση του στην έκφραση της HAS2 ισομορφής και της βιοσύνθεσης του HA από τους οστεοβλάστες. Συμπερασματικά, ο TGF-β2 μπορεί να έχει ρόλο στη μεταστατική δυνατότητα των κυττάρων του ανθρώπινου οστεοσαρκώματος.
Οι μικρές πλούσιες σε λευκίνη πρωτεογλυκάνες (SLRP) όπως είναι η διγλυκάνη (biglycan), η διακοσμιτίνη (decorin), η φιμπρομοδουλίνη (fibromodulin), η λουμικάνη (lumican) και η οστεοαδχερίνη (osteoadherin) είναι οι πιο άφθονες πρωτεογλυκάνες του οστεοειδούς. Το χαρακτηριστικό σε σχήμα πετάλου αλόγου του πρωτεϊνικού τους κορμού, τους επιτρέπει να αλληλεπιδρούν με άλλα συστατικά της εξωκυττάριας ουσίας (κυρίως με ίνες κολλαγόνου), αλλά και με την ανόργανη φάση στη διάρκεια της ασβεστοποίησης. Η έκφραση της λουμικάνης δεν ήταν γνωστή στο ανθρώπινο οστεοσάρκωμα μέχρι την ανάδειξη της από την παρούσα μελέτη.
Εξετάσαμε την έκφραση της λουμικάνης στα MG-63 και στα Saos 2 κύτταρα ανθρώπινου οστεοσαρκώματος. Αυτές οι κυτταρικές σειρές ανθρώπινου οστεοσαρκώματος εκφράζουν και εκκρίνουν την λουμικάνη μερικώς γλυκοζυλιωμένη με τις αλυσίδες θειϊκής κερατάνης (KS). Είναι ενδιαφέρον, ότι τα μη μεταστατικά καλώς διαφοροποιημένα Saos 2 κύτταρα παρήγαγαν λουμικάνη επτά φορές περισσότερη συγκρινόμενη με εκείνη που παρήγαγαν τα υψηλής μεταστατικής ικανότητας κύτταρα της MG-63 σειράς. Η χρησιμοποίηση ειδικού siRNA για το γονίδιο της λουμικάνης κατέστειλε τα επίπεδα του mRNA και στις δύο κυτταρικές σειρές. Η ανάπτυξη των Saos 2 κυττάρων ανεστάλη, ενώ η μετανάστευση και η χημειοτακτική απάντηση στην ινονεκτίνη αυξήθηκε από την λουμικάνη. Η έκφραση της λουμικάνης είχε αρνητική συσχέτιση με το βασικό επίπεδο της Smad 2 ενεργοποίησης. Από την άλλη μεριά, αυτές οι κυτταρικές λειτουργίες στα υψηλής επιθετικότητας MG-63 κύτταρα, δεν ήταν ευαίσθητες στην καταστολή των ενδογενών χαμηλών επιπέδων λουμικάνης που παράγουν αυτά τα κύτταρα. Τα αποτελέσματα αυτά καταδεικνύουν ότι η έκφραση της λουμικάνης μπορεί να σχετίζεται θετικά με την διαφοροποίηση των κυττάρων του οστεοσαρκώματος και αρνητικά με την εξέλιξή τους.
Η διακοσμιτίνη είναι μια καλά μελετημένη μικρή πλούσια σε λευκίνη πρωτεογλυκάνη για την οποία βρέθηκε ότι έχει ανασταλτική δράση στο πολλαπλασιασμό διαφόρων κυτταρικών σειρών. Έχει αναφερθεί ότι η διακοσμιτίνη επιδρά μέσα από το μονοπάτι του EGFR προκαλώντας απόπτωση / αναστολή ανάπτυξης. Ο σκοπός της παρούσας φάσης της μελέτης μας ήταν να εξετασθεί η ρύθμιση της σύνθεσης της διακοσμιτίνης μετά από χορήγηση του TGF-β2, του PDGF-BB και του bFGF στις MG-63 και Saos 2 κυτταρικές σειρές ανθρώπινου οστεοσαρκώματος όπως και στα κύτταρα ανθρώπινων φυσιολογικών οστεοβλαστών.
Επίσης μελετήθηκε η επίδραση της διακοσμιτίνης στην ανάπτυξη των κυττάρων του οστεοσαρκώματος. Βρέθηκε ότι τα MG-63 κύτταρα εκφράζουν την διακοσμιτίνη ενώ τα Saos 2 και τα φυσιολογικά κύτταρα των οστεοβλαστών δεν την εκφράζουν. Η έκφραση της διακοσμιτίνης αυξήθηκε μετά από τη χορήγηση όλων των αυξητικών παραγόντων, ενώ τα Saos 2 και τα φυσιολογικά κύτταρα των οστεοβλαστών δεν διεγέρθηκαν από κανένα από τους αυξητικούς παράγοντες οι οποίοι χρησιμοποιήθηκαν για να συνθέσουν την διακοσμιτίνη. Η χορήγηση της διακοσμιτίνης είχε ανασταλτική επίδραση στη ανάπτυξη των Saos 2 κυττάρων, ενώ τα MG-63 κύτταρα δεν επηρεάστηκαν. Η καταστολή της σύνθεσης της διακοσμιτίνης στα MG-63 κύτταρα δεν είχε επίδραση στο πολλαπλασιασμό τους. Αντίθετα, η διακοσμιτίνη φάνηκε να έχει ευεργετική επίδραση στα κύτταρα του οστεοσαρκώματος αφ’ενός διότι ήταν απαραίτητη για την μετανάστευση των MG-63 κύτταρων και αφ’ετέρου διότι εμπόδισε την επαγώμενη από το TGF-β2 κυτταροστατική λειτουργία. Η ανάλυση αυτών των δραστηριοτήτων της διακοσμιτίνης στα MG-63 κύτταρα έδειξε ότι δεν επάγει την έκφραση της p21WAF-1, ούτε προκαλεί παρατεταμένη αναίρεση και αδρανοποίηση του EGFR. Αντίθετα, ο EGFR φάνηκε να υπερεκφράζεται και να παραμένει δια μακρόν φωσφορυλιωμένος. Επιπρόσθετα, φάνηκε ότι για τα αυξημένα επίπεδα του EGFR δεν χρειάζεται ενεργοποιημένη σηματοδότηση του EGFR, υποδηλώνοντας ότι μπορεί να επιτευχθεί σταθεροποίηση των υποδοχέων αυτών μέσω των αλληλεπιδράσεων της εξωκυττάριας διακοσμιτίνης και του EGFR. Σαν συμπέρασμα συνάγεται ότι τα MG-63 κύτταρα είναι ανθεκτικά στην αναστολή της ανάπτυξης που προκαλείται από την διακοσμιτίνη.
Το Ν-ακετυλνιουραμινικό οξύ (Neu5Ac) και το Ν-γλυκολυλνιουραμινικό οξύ (Neu5Gc) είναι τα επικρατούντα σιαλικά οξέα (Sia) στα θηλαστικά που συνήθως βρίσκονται στα μη αναγώμενα άκρα των ολιγοζαχαριδικών αλυσίδων στις γλυκοπρωτεϊνες και τα γλυκολιπίδια. Προσδιορίστηκε ότι τα MG-63 κύτταρα παράγουν πάνω από 5 φορές περισσότερο ολικό σιαλικό οξύ συγκρινόμενο με τα Saos-2 κύτταρα. Το Neu5Ac υπολογίστηκε στο περίπου 60% των ολικών σιαλικών οξέων που εκκρίθηκαν από τα MG-63 κύτταρα, ενώ το Neu5Gc ήταν το κύριο σιαλικό οξύ στην κυτταρική μεμβράνη των MG-63 κυττάρων. Τα Saos-2 κύτταρα εκκρίνουν αξιόλογες ποσότητες του Neu5Ac στο υπερκείμενο. Τα αποτελέσματα αυτά έδειξαν ότι τα κύτταρα του ανθρώπινου οστεοσαρκώματος εκφράζουν αμφότερους τους τύπους γλυκοζυζευγμάτων που περιέχουν σιαλικά οξέα, οι δε διαφορές στις ποσότητες του καθενός από τους δύο κύριους τύπους σιαλικών οξέων καθώς και η κατανομή τους μπορεί να σχετίζεται με τις διαφορές τους στην μορφολογία και την μεταστατική τους ικανότητα .
|
Αναζήτηση
