Your browser does not support JavaScript!

Αρχική    ¨Ελεγχος της αντιλεϊσμανιακής δράσης νέων αιθερικών φωσφολιπιδίων : Μελέτη του μηχανισμού-στόχου των δραστικών ουσιών και του μηχανισμού ανάπτυξης της αντοχής του παρασίτου / Ειρήνη Φραγκιαδάκη.  

Αποτελέσματα - Λεπτομέρειες

Προσθήκη στο καλάθι
[Προσθήκη στο καλάθι]
Κωδικός Πόρου 000460430
Τίτλος ¨Ελεγχος της αντιλεϊσμανιακής δράσης νέων αιθερικών φωσφολιπιδίων : Μελέτη του μηχανισμού-στόχου των δραστικών ουσιών και του μηχανισμού ανάπτυξης της αντοχής του παρασίτου / Ειρήνη Φραγκιαδάκη.
Άλλος τίτλος Screening of the antileishmanial action of new ether lipid analogues
Συγγραφέας Φραγκιαδάκη, Ειρήνη
Σύμβουλος διατριβής Σκουλίκα, Ευσταθία
Μέλος κριτικής επιτροπής Τσιώτης, Γεώργιος
Καλογεροπούλου, Θεοδώρα
Περίληψη Η λεϊσμανίαση προκαλείται από το παράσιτο του γένους Leishmania και θεωρείται μια από τις πιο σημαντικές τροπικές, παρασιτικές ασθένειες, προσβάλλοντας παγκοσμίως 12 εκατομμύρια ανθρώπους1. Τα σοβαρά προβλήματα που σχετίζονται με τη θεραπεία της λεϊσμανίασης, όπως η ανάπτυξη αντοχής στα διαθέσιμα φάρμακα, η ανάγκη για θεραπείες χαμηλού κόστους σε συνδυασμό με τη χαμηλή χρηματοδότηση για τη μελέτη της θεραπείας των παρασιτικών ασθενειών, ώθησαν αρκετές ερευνητικές ομάδες να συνθέσουν νέες αντι-λεϊσμανιακές ουσίες βασισμένες σε τροποποιήσεις ήδη υπάρχοντων φαρμάκων2-7. Παρά το γεγονός ότι έχουν παρέλθει πάνω από τρεις δεκαετίες από την ανακάλυψη της αντιλεϊσμανιακής δράσης της μιλτεφοσίνης, που αποτελεί το πρώτο φάρμακο κατά της λεισμανίασης που χορηγείται από το στόμα8, η γνώση γύρω από τη σχέση δομής-αντιπαρασιτικής δράσης αναλόγων του φαρμάκου είναι σχετικά περιορισμένη9. Όλα τα παραπάνω καθιστούν το πεδίο του σχεδιασμού και της σύνθεσης νέων αντιλεϊσμανιακών αναλόγων φωσφολιπιδίων μια συνεχή πρόκληση, οδηγώντας στην παραγωγή αναλόγων της μιλτεφοσίνης, η βιολογική δράση των οποίων αποτιμήθηκε στην παρούσα διατριβή. Συγκεκριμένα μελετήθηκαν 55 ανάλογα αιθερικών φωσφολιπιδίων ως προς την αντιπαρασιτική τους δράση, στην προμαστιγωτή και την ενδοκυττάρια αμαστιγωτή μορφή του παρασίτου. Επιπρόσθετα μελετήθηκε η κυτταροτοξική δράση των αναλόγων έναντι της κυτταρικής σειράς ανθρώπινων μακροφάγων THP1, καθώς και η αιμολυτική τους δράση. Τα ανάλογα που μελετήθηκαν στην πλειοψηφία τους ήταν πιο ενεργά από τη μιλτεφοσίνη και στα δύο εργαστηριακά στελέχη του παρασίτου που χρησιμοποιήθηκαν, ενώ σημαντικά βελτιωμένη παρατηρήθηκε και η κυτταροτοξική/αιμολυτική τους δράση, αναδεικνύοντας έτσι τα δομικά χαρακτηριστικά που επηρεάζουν τις ιδιότητές τους10-13. Ποικίλες μελέτες έχουν αναφέρει διαφορές στην ανταπόκριση των εργαστηριακών και κλινικών στελεχών στα αντιπαρασιτικά φάρμακα, που μπορούν να αποδοθούν σε ποικιλομορφίες στους μηχανισμούς που μεσολαβούν στην πρόσληψη του φαρμάκου ή/και την αλληλεπίδρασή του με τους κυτταρικούς στόχους14, 15. Για τον λόγο αυτό μελετήθηκε η δράση επιλεγμένων αναλόγων σε κλινικά στελέχη που απομονώθηκαν από σκύλους πάσχοντες με σπλαχνική λεϊσμανίαση (kala azar), αναδεικνύοντας σημαντικές διαφορές στην ανταπόκριση των κλινικών στελεχών στα ανάλογα που χρησιμοποιήθηκαν. Ωστόσο δεν παρατηρήθηκε συσχέτιση των παραπάνω διαφορών με την ύπαρξη πολυμορφισμών στο γονίδιο της ATP-ασης LdMT (Leishmania donovani Miltefosine Transporter), που ευθύνεται για τη μειωμένη πρόσληψη του φαρμάκου και την ανάπτυξη αντοχής στη μιλτεφοσίνη16. Συμπεραίνεται επομένως ότι η δράση των αναλόγων και κατ’επέκταση το τελικό παρασιτοκτόνο αποτέλεσμα καθορίζεται από τον συνδυασμό της χημικής δομής του φαρμάκου και των βιοτυπικών χαρακτηριστικών του κάθε στελέχους. Δεδομένου ότι η κατανόηση του τρόπου δράσης μιας ουσίας είναι καθοριστική για την αναγνώριση πιθανών φαρμακευτικών στόχων και τον σχεδιασμό νέων θεραπευτικών στρατηγικών, μελετήσαμε τους μηχανισμούς που εμπλέκονται στην παρασιτοκτόνο δράση των αναλόγων. Κυτταρικά φαινόμενα όπως η επαγωγή της αυτοφαγίας, η απόπτωση, η απώλεια της πόλωσης της μιτοχονδριακής μεμβράνης και η επαγωγή του οξειδωτικού στρες, μελετήθηκαν χρησιμοποιώντας επιλεγμένα ενεργά ανάλογα. Επιπρόσθετα, μελετήθηκε η ενδοκυττάρια κατανομή του φαρμάκου με τη χρήση φθοριζόντων αναλόγων. Κατά την αποτίμηση της δράσης των αναλόγων στην ενδοκυττάρια αμαστιγωτή μορφή, παρατηρήθηκε μικροσκοπικά, η ύπαρξη πολυάριθμων κυστιδίων μέσα στα μολυσμένα μακροφάγα, αλλά και εντός του παρασιτοφόρου κυστιδίου, γεγονός που επιβεβαιώθηκε και με τη χρήση ηλεκτρονικού μικροσκοπίου. Προκειμένου να μελετήσουμε αν τα παραπάνω κυστίδια εμπλέκονται στο παρασιτοκτόνο αποτέλεσμα, μέσω της επαγωγής της αυτοφαγικής διαδικασίας, έγινε χρώση με τον ειδικό δείκτη για την αυτοφαγία Monodancyl Cadaverine (MDC) και αντισώματα έναντι της πρωτεϊνης LAMP (Lysosome Associated Membrane Protein)17, 18. Με αυτά τα πειράματα διακρίναμε σημαντικές διαφορές στη ροή των αυτοφαγικών κυστιδίων και την ωρίμανση των αυτοφαγοσωμάτων μετά από την επίδραση επιλεγμένων ενεργών αναλόγων, ως προς τη προσθήκη χημικών ομάδων στη λιπιδική αλυσίδα της μιλτεφοσίνης. Τα ανάλογα με τριφλουραλίνη και τριαζόλιο προκάλεσαν αξιοσημείωτη αύξηση της αυτοφαγικής ροής στα μολυσμένα μακροφάγα, σε αντίθεση με τη μιλτεφοσίνη και τα ανάλογα TC19 και TCAN26, που περιέχουν άλλου είδους δακτύλιους. Επειδή αυτές οι δοκιμασίες δεν συσχετίζουν άμεσα το τελικό παρασιτοκτόνο αποτέλεσμα με την επαγωγή της ωρίμανσης των φαγοσωμάτων και αυτοφαγοσωμάτων, μελετήθηκε η επαγωγή της απόπτωσης μολυσμένων μακροφάγων, μετά την επίδραση μιλτεφοσίνης και επιλεγμένων αναλόγων. Με τη χρήση της φθορίζουσας πρωτεΐνης Annexin V και του ιωδιούχου προπιδίου αφ’ ενός19, 20, και του δείκτη της μιτοχονδριακής ομοιόστασης MitoTracker Red Dye αφ’ ετέρου21, 22, αναδείξαμε την επίδραση της μιλτεφοσίνης και των αναλόγων φωσφολιπιδίων στη μιτοχονδριακή λειτουργία, απόπτωση και θάνατο σε μολυσμένα μακροφάγα. Δείξαμε ότι η μιλτεφοσίνη σε συγκεντρώσεις 7,5x της IC50 έναντι του ενδοκυττάριου παρασίτου, σκοτώνει περίπου το 78% των μολυσμένων κυττάρων σε αντίθεση με το ανάλογο TC95 που το αντίστοιχο ποσοστό είναι <10%. Το αποτέλεσμα της ισχυρής κυτταροτοξικότητας της μιλτεφοσίνης φαίνεται στην δραστική μείωση της μιτοχονδριακής λειτουργίας και της ολοκληρωτικής απώλειας του δυναμικού της μεμβράνης. H επίδραση αυτή είναι δοσοεξαρτώμενη και μόνο σε υποθεραπευτικές ως προς το παρασιτοκτόνο αποτέλεσμα συγκεντρώσεις, μπορεί να μειωθεί. Αντίθετα, άλλα ανάλογα όπως το ΤC95 σε συγκεντρώσεις πολλαπλάσιες της IC50 δεν επηρεάζουν την ομοιόσταση του ξενιστή. Το μιτοχόνδριο λειτουργεί ως σημαντική πηγή για την παραγωγή ενεργών μορίων οξυγόνου (Reactive Oxygen Species, ROS) μέσα στα κύτταρα, και συγκεκριμένα έχει προταθεί ότι η μιλτεφοσίνη δρα μέσω του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου που σχετίζεται με την παραγωγή ROS23. Στη μελέτη μας παρατηρήθηκε αυξημένη παραγωγή ριζών Οξειδίου του Αζώτου (NO-) στις πρώτες ώρες επώασης με επιλεγμένα ανάλογα, που συνοδεύεται από χαμηλό ποσοστό επιβίωσης των προμαστιγωτών. Τα παραπάνω αποτελέσματα έθεσαν το ερώτημα της ενδοκυττάριας κατανομής των αλκυλοφωφοχολινών στο προμαστιγωτό και στο κύτταρο-ξενιστή. Χρησιμοποιήθηκαν τρία φθορίζοντα ανάλογα με τριαζόλιο και αδαμαντάνιο στη λιπιδική αλυσίδα. Τα δυο από αυτά είχαν ισχυρό φθορισμό που επέτρεπε την ιχνιλάτησή τους στο μικροσκόπιο φθορισμού. Παρατηρήθηκε κυτταροπλασματική συσσώρευση του φθορισμού σε περιοχές που ταυτίζονται με τη μιτοχονδριακή χρωστική Mitotracker Red Dye, ενισχύοντας έτσι την υπόθεση ότι η αναστολή των μιτοχονδριακών λειτουργιών που προκαλεί η μιλτεφοσίνη οφείλεται στη συσσώρευσή της στο οργανίδιο του προμαστιγωτού. Παραμένει όμως το ερώτημα της κατανομής των αναλόγων με μειωμένη κυτταροτοξικότητα. Επειδή τα in vitro αποτελέσματα ήταν ενθαρρυντικά για ορισμένα ανάλογα και κυρίως για τα ανάλογα με τον δακτύλιο της τριφλουραλίνης, προχωρήσαμε σε in vivo μελέτες επίδρασης σε σκύλο με ενεργό kala azar. Εφαρμόσαμε τα εγκεκριμένα θεραπευτικά πρωτόκολλα της μιλτεφοσίνης για ένα σκύλο που θα λάμβανε το ανάλογο TC106, με παρόμοια χαρακτηριστικά με το ανάλογο TC95 αλλά μικρότερη κυτταροτοξικότητα. Η σύγκριση έγινε με σκύλο που έλαβε το κτηνιατρικό φαρμακευτικό σκεύασμα Μilteforan®. Τα αποτελέσματα ήταν ιδιαίτερα ενθαρρυντικά ως προς την υποχώρηση των συμπτωμάτων και τη σημαντική βελτίωση της κλινικής εικόνας. Το ζώο που έλαβε το TC106 είχε σταθερούς αιματολογικούς και ηπατικούς δείκτες κατά τη θεραπεία, σημαντικά βελτιωμένους σε σύγκριση με το ζώο που έλαβε το Μilteforan®. Το πιο σημαντικό ήταν ότι ο σκύλος που έλαβε το πειραματικό φάρμακο δεν παρουσίασε τις ανεπιθύμητες ενέργειες όπως ευερεθιστότητα, έμετος και διάρροια που παρατηρούνται συχνά κατά τη θεραπεία με μιλτεφοσίνη. Παρά τα ενδιαφέροντα κλινικά αποτελέσματα, το παράσιτο ήταν ανιχνεύσιμο στους λεμφαδένες και των δυο σκύλων τουλάχιστον 40 ημέρες μετά το πέρας της θεραπείας. Λαμβάνοντας υπόψιν τα παραπάνω ευρήματα στον σκύλο, σε συνδυασμό με τη μειωμένη αποτελεσματικότητα των διαθέσιμων θεραπειών που παρατηρείται τα τελευταία χρόνια και στον άνθρωπο, η χρήση συνδυαστικής θεραπείας για την καταπολέμηση του kala azar γίνεται ολοένα και πιο συχνή, καθώς η συνεργητική δράση των φαρμάκων οδηγεί σε ύφεση της ασθένειας και στην αποφυγή υποτροπών24-27. Για τον λόγο αυτό, αποπειραθήκαμε να αξιοποιήσουμε την ενδεχόμενη συνεργητική δράση επιλεγμένου αναλόγου και της μιλτεφοσίνης, σε συνδυασμό με μία τάξη αντι-μικροβιακών πεπτιδίων, που ονομάζονται peptaibols. Παρατηρήθηκε ότι ο συνδυασμός των peptaibols με τα φωσφολιπίδια είχε συνεργητική επίδραση έναντι του ενδοκυττάριου παρασίτου, επέφερε μεταβολές στα επίπεδα οξειδοαναγωγής των προμαστιγωτών, οδήγησε σε κατακερματισμό της διαφοράς δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης και προκάλεσε αλλαγές στη μορφολογία των μιτοχονδρίων. Επομένως, συμπεραίνεται ότι η συνέργεια που παρατηρήθηκε in vitro ανάμεσα στα φωφολιπίδια και τα peptaibols οδηγεί σε βελτίωση της αντιπαρασιτικής δράσης28. Συχνά, η αδυναμία εκρίζωσης του παθογόνου από την κλινική θέση μόλυνσης οφείλεται στη φαινοτυπική ανάπτυξη ανθεκτικών/προσαρμοσμένων στελεχών του παθογόνου στα φάρμακα. Θελήσαμε να μελετήσουμε πιθανούς μηχανισμούς προσαρμογής του παρασίτου στις αλκυλοφωσφοχολίνες, με απώτερο στόχο την κατανόηση των ανεκτικών πληθυσμών και την εύρεση νέων στόχων θεραπείας για την αποτελεσματική εκρίζωσή του. Καλλιεργήσαμε στέλεχος L. donovani σε υποθεραπευτικές δόσεις μιλτεφοσίνης και του αναλόγου TC19, και αναλύσαμε με την χρήση πρωτεωμικής την έκφραση των πρωτεϊνών. Ανασυνθέσαμε τους κυριότερους μηχανισμούς παραγωγής ενέργειας, μεταβολισμού των λιπιδίων και μεταφοράς των αλκυλοφωσφοχολινών στο προμαστιγωτό. Βρήκαμε ομοιότητες στην επαγωγή της έκφρασης των κεντρικών μεταβολικών μηχανισμών μεταξύ των δύο αναλόγων, όπως η βιοσύνθεση των στερολών και λιπαρών οξέων μεγάλης αλυσίδας και η οξειδωτική φωσφορυλίωση στα μιτοχόνδρια. Βρήκαμε όμως και σημαντικές διαφορές στην παραγωγή ενέργειας από τη γλυκόλυση και τον καταβολισμό των λιπαρών οξέων στα μιτοχόνδρια μέσω της β-οξείδωσης. Βρήκαμε επίσης ότι οι δύο ουσίες δεν χρησιμοποιούν τον ίδιο μηχανισμό εισόδου στο κυτταρόπλασμα. Συμπερασματικά, πολλά ανάλογα της μιλτεφοσίνης έχουν εξαιρετικά βελτιωμένα χαρακτηριστικά ως προς την επίδραση έναντι του παρασίτου και του ξενιστή. Η βαθύτερη μελέτη της ικανότητας τους να χρησιμοποιούν μηχανισμούς απομάκρυνσης του παρασίτου από τον ξενιστή, είναι σημαντική για την κατανόηση του αποτελεσματικού τρόπου δράσης. Η μελέτη των μηχανισμών επιβίωσης του παρασίτου in vivo είναι σημαντική για την ανάδειξη νέων φαρμακευτικών στόχων και την εφαρμογή συνεργητικών θεραπειών για την αποτελεσματική εκρίζωση του παρασίτου.
Φυσική περιγραφή 158 σ. : σχεδ., πιν., εικ.(μερ. εγχρ.) ; 30 εκ.
Γλώσσα Ελληνικά, Αγγλικά
Θέμα Autophagy
Canine therapy
Drug synergy
Leishmaniasis
Mechanism of action
Miltefosine analoques
Mitochondria
Oxidative stress
Ανάλογα μιλτεφοσίνης
Απόπτωση
Αυτοφαγία
Θεραπεία στο σκύλο
Λεϊσμανίαση
Μηχανισμός προσαρμογής
Οξειδωτικό στρεσ
Συνεργεία φαρμάκων
Ημερομηνία έκδοσης 2023-12-08
Συλλογή   Σχολή/Τμήμα--Ιατρική Σχολή--Τμήμα Ιατρικής--Διδακτορικές διατριβές
  Τύπος Εργασίας--Διδακτορικές διατριβές
Εμφανίσεις 810

Ψηφιακά τεκμήρια
No preview available

Κατέβασμα Εγγράφου
Προβολή Εγγράφου
Εμφανίσεις : 2